豬傳染性胃腸炎病毒N蛋白的原核表達及間接ELISA方法的建立與應用.pdf

1、豬傳染性胃腸炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起的一種以嘔吐、水樣腹瀉、脫水等為主要癥狀的腸道傳染性疾病。仔豬感染后死亡率能達到100％，該病的爆發(fā)和流行給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。TGEV核衣殼蛋白（N蛋白）是一種重要的病毒抗原，感染機體后表達量大，感染早期即可檢測到TGEVN蛋白抗體，是建

2、立間接ELISA方法的理想抗原。本研究利用重組TGEV抗原蛋白建立的間接ELISA方法，能夠檢測豬血清TGEV抗體水平。主要研究內容包括如下2個方面:
　　1.采用RT-PCR方法對TGEV江蘇分離株(JS2012)的N基因進行了擴增，將其插入到pET28a載體上，經酶切鑒定、測序鑒定正確后，轉化至感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，并進行誘導表達。表達產物經SDS-PAGE電泳分析，結果表明目的蛋白成功表達，且分子質量為42ku;該

3、蛋白能夠以融合蛋白的形式表達，可在實驗室內大量制備并進行純化;蛋白免疫印跡結果顯示，表達的N蛋白能具有良好的反應原性;
　　2.使用該重組N蛋白建立了抗體檢測間接ELISA方法，對各組分和步驟進行了優(yōu)化，確定最佳工作條件為:以0.152ug/ml的抗原包被濃度于37℃包被2h，用5％的脫脂乳封閉30min，待檢血清作1∶80稀釋，于37℃反應30min后，酶標二抗作1∶10000稀釋后，于37℃反應30min后，加入顯色液于室溫下

4、避光反應10min。另外，包被的重組N蛋白不與PEDV、CSFV、PRRSV、FMDV和PCV2陽性血清發(fā)生交叉反應，表明該方法具有良好的特異性;陽性血清稀釋到1∶1280仍檢測為陽性，表明該方法具有良好的敏感性;批內重復性試驗和批間重復性試驗的變異系數均小于10％，表明該方法具有良好的穩(wěn)定性;分別用間接ELISA與病毒血清中和試驗檢測80份臨床樣品，間接ELISA方法的陽性檢出率為81.25％，病毒血清中和試驗的陽性檢出率為82.5％