豬傳染性胃腸炎病毒S基因表達的研究及其原核表達產(chǎn)物的生物學(xué)活性分析.pdf

1、冠狀病毒是引起人和動物的呼吸道與腸道感染的一種重要病原，還有些冠狀病毒能引起動物的肝炎和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。冠狀病毒自發(fā)現(xiàn)后，隨著對其危害認識的加深，研究也逐漸深入，尤其在2002年末冠狀病毒的新成員——SARS病毒出現(xiàn)以后，對于冠狀病毒的研究更加備受人們的關(guān)注。 豬傳染性胃腸炎病毒(TransmissibleGastroenteritisofSwine，TGE)是豬冠狀病毒的主要代表，由它引起的豬傳染性胃腸炎是豬的一種高度接觸性傳染

2、病，不同年齡和品種的豬都易感，尤其以仔豬最易感，目前該病已遍布全世界各養(yǎng)豬國家，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重損失。1984年P(guān)ensaert等在比利時首次分離出一種與TGEV相近的、具有呼吸道嗜性的病原，稱為豬呼吸道冠狀病毒(PorcineRespiratoryCoronavirus，PRCV)。它常和其他的呼吸道疾病發(fā)生混合感染而引起豬呼吸系統(tǒng)綜合征，可常年不斷發(fā)病，使豬只成批死亡。目前，該病在世界各地尤其是歐洲國家已廣泛存在。 TGE

3、V是單股正鏈RNA病毒，主要編碼纖突糖蛋白(S蛋白)、膜結(jié)合蛋白(M蛋白)、核衣殼蛋白(N蛋白)、小膜蛋白(sM蛋白)4種結(jié)構(gòu)蛋白。其中S蛋白對TGEV是非常重要的，是唯一能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護作用的結(jié)構(gòu)蛋白。 目前，普遍認為PRCV為TGEV的基因缺失變異株，兩者在結(jié)構(gòu)上非常相似，基因組同源性達到96％以上。兩者的區(qū)別主要在于，PRCV的S基因不存在B、C兩個抗原位點，同時PRCV的ORF3/3a和ORF3-1/

4、3b有不同程度的缺失。而且，由于PRCV和TGEV的抗原關(guān)系密切，二者能誘導(dǎo)出具有完全交叉反應(yīng)的中和抗體，常規(guī)的血清學(xué)檢測方法存在交叉反應(yīng)，臨床上不能將它們區(qū)分開。因此建立上述兩種病毒感染的血清學(xué)鑒別診斷方法，用于檢測臨床上TGEV的感染，對于豬場TGE的綜合防制是非常重要的。同時對于那些TGEV陰性而PRCV普遍存在的國家若想向TGEV陰性的國家出口種豬，鑒別診斷則成了決定貿(mào)易能否成功的關(guān)鍵因素之一。 在本研究中，我們根據(jù)Ge

5、nbank上已登錄的TGEVS基因序列，設(shè)計了兩對引物P1、P2和P3、P4。首先將TGEVPurdue標準毒株接種已長成單層的PK-15細胞進行病毒的增殖。然后提取TGEV的基因組RNA，進行RT-PCR，分別擴增出目的片段S1和S1-2，其中S1片段含TGEVS基因近5()端的680bp片段，為PRCV缺失部分；S1-2片段含TGEVS基因近5()端的的2199bp，包含片段S1和TGEV與PRCV共有部分，它包含了TGEVS基因的

6、全部四個抗原位點。將這兩個片段克隆到pGEM-T載體上后進行了序列測定，進而構(gòu)建了原核表達載體pGEX-S1、pGEX-S1-2，經(jīng)誘導(dǎo)這兩個片段在大腸桿菌BL21中得到了高效表達。表達產(chǎn)物大小分別為52KD和108KD，Western-blot檢測表明，表達的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。 以表達的融合蛋白為抗原初步建立了間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法；用方陣滴定確定其最佳抗原包被濃度分別是5μg/mL、10μg/mL，最佳

7、血清稀釋倍數(shù)均為1：40。 為了更好地消除非特異性反應(yīng)，增強表達產(chǎn)物的抗原性，利用桿狀病毒表達系統(tǒng)可進行翻譯后修飾等特點，我們試圖在sf9昆蟲細胞中進行目的基因的表達。目前已成功構(gòu)建了重組桿狀病毒穿梭表達載體Bacmid-S1、Bacmid-S1-2，為目的基因桿狀病毒表達的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。 本研究在TGEV病毒增殖的基礎(chǔ)上，克隆了TGEVS基因的兩個不同區(qū)段，構(gòu)建了原核表達載體并進行了表達，利用原核表達產(chǎn)物初步建