豬傳染性胃腸炎病毒S基因抗原位點區(qū)的表達(dá)及其優(yōu)化.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Transmissible gastroenteritis of swine，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)引起的一種高接觸性傳染病。在TGEV編碼的四種結(jié)構(gòu)蛋白中，只有纖突蛋白(S蛋白)能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。而位于S蛋白近N端A、B、C、D四個主要抗原位點片段誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用，幾乎相當(dāng)于整個S蛋白產(chǎn)生的誘導(dǎo)效應(yīng)

2、。因此，對于S蛋白抗原位點區(qū)的研究可以為TGE的診斷，預(yù)防提供一定的基礎(chǔ)條件。 本研究以S基因抗原位點區(qū)作為目的基因，將其克隆至原核表達(dá)載體pET-28a中，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)菌株后，以IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western-blot檢測均與預(yù)期結(jié)果相符的基礎(chǔ)上，利用自動誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)一步提高目的蛋白的表達(dá)量。相關(guān)結(jié)果如下： 1．以帶有全長S基因的質(zhì)粒pGS為模板，通過

3、PCR擴(kuò)增2.1 kb的S基因抗原位點片段S<,1>。并將其定向克隆至原核表達(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建了pET-S<,1>原核表達(dá)重組質(zhì)粒。 2．將帶有重組質(zhì)粒pET-S<,1>的BL21(DE3)菌株，分別于37℃、30℃、28℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h后，收集菌液稀釋10<'5>倍，涂布含Kana<'r>和無抗性的LB平板，經(jīng)菌落計數(shù)表明，在37℃和30℃誘導(dǎo)時，分別約有60％和30％的大腸桿菌細(xì)胞丟失重組質(zhì)粒；而28℃誘導(dǎo)則pE

4、T-S<,1>在大腸桿菌BL21(DE3)中可較穩(wěn)定存在。SDS-PAGE電泳顯示，37℃、30℃誘導(dǎo)條件下蛋白表達(dá)不明顯，而將誘導(dǎo)溫度降低至28℃時可明顯提高目的蛋白的表達(dá)。 3．在28℃條件下以IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western-blot檢測表明，目的蛋白產(chǎn)物大小與預(yù)期一致為76 ku，并且具有天然蛋白抗原性。通過凝膠分析軟件Bandscan分析顯示，隨培養(yǎng)時間的增加，目的蛋白表達(dá)量逐漸增加，最

5、高約占細(xì)菌總蛋白的25.9％。未誘導(dǎo)的對照組也有少量目的蛋白的表達(dá)，約占菌體總蛋白的3.3％。 4．分別設(shè)置pET-S<,1>轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組，通過測定菌液振搖培養(yǎng)相同時間的OD600值表明，未誘導(dǎo)組在振搖培養(yǎng)初期菌液的OD600值可達(dá)到3.65，最高可達(dá)到6.19；而誘導(dǎo)組菌液的OD600值最高只可達(dá)到2.68，由此說明誘導(dǎo)開始后菌株的生長在一定程度上受到了限制。 5．利用自動誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，通過重新定義菌株復(fù)蘇