豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉病毒的分離、鑒定及部分基因序列分析.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(TGE)和豬流行性腹瀉(PED)均由冠狀病毒引起，臨床上主要以嘔吐、腹瀉和脫水為特征，對哺乳仔豬的致死率可達100％，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。特別是近年來其發(fā)生率明顯升高，因此，作者對河南省不同地區(qū)的豬場進行了TGE和PED感染和流行情況的調(diào)查，并對流行毒株進行了相關(guān)研究。 參照Genbank中登錄的基因序列(NC002306和NC003436)分別設(shè)計了擴增豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)(P1/P2)和豬

2、流行性腹瀉病毒(PEDV)(P3/P4)的兩對引物，P1/P2的擴增長度為497bp，P3/P4的擴增長度為854bp。通過優(yōu)化反應(yīng)條件，作者首先建立了分別檢測TGE和PED的單一RT-PCR方法，用其分別擴增豬胃-流二聯(lián)弱毒活疫苗中TGEV和PEDV的目的基因，并進行連接、轉(zhuǎn)化、克隆和測序。結(jié)果表明TGEV和PEDV目的基因的同源性均在98.5％以上，證明了擴增目的基因的正確性。隨后建立了同時檢測TGE和PED的多重RT-PCR方法。

3、用該方法檢測7份臨床疑似TGE和PED的腸道內(nèi)容物，結(jié)果表明TGE和PED均為陽性。同時用單一RT-PCR方法和韓國進口試紙卡檢測同樣的7份樣品，與多重RT-PCR方法檢測相比，結(jié)果表明TGE的符合率分別為7/7和7/7，PED的符合率分別為7/7和5/7。 對RT-PCR檢測呈陽性結(jié)果的7份臨診病料進行病毒的分離、鑒定，結(jié)果均分離到病毒，但所分離物全為TGE和PED混合病毒TGE-PED(HN)。在PK-15細胞和Vero細胞

4、上連續(xù)多次傳代后仍表現(xiàn)為二者的混合感染。選用瓊脂粉作為固定介質(zhì)，試圖通過蝕斑技術(shù)對分離到的混合病毒TGE-PED(HN)進行克隆、純化，但經(jīng)多次努力均未成功。隨后對分離到的TGE-PED(HN)中TGEV S基因和PEDV M基因進行了克隆、測序和序列分析，結(jié)果表明TGEV S基因(序列登錄號為EU287428)同豬胃腸炎弱毒活疫苗株之間的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為99.0％和97.6％，在進化關(guān)系中與已報道的四川分離株(DQ

5、443743)之間的進化距離最近；PEDV M基因(序列登錄號為EU287429)同豬流行性腹瀉弱毒活疫苗株之間的核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分別為99.7％和97.0％，在進化關(guān)系中與豬流行性腹瀉弱毒活疫苗株之間的進化距離最近。但是目前還不能說明TGE-PED(HN)是否與豬胃-流二聯(lián)弱毒活疫苗株的毒力返強有關(guān)。 本研究分離到了河南株豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒，對研究TGE-PED(HN)和豬胃-流二聯(lián)弱毒活疫苗株