豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉二聯(lián)RT-PCR診斷方法的建立及初步應用.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(TGE)和豬流行性腹瀉(PED)均是由冠狀病毒引起的以仔豬嘔吐、腹瀉和脫水為特征的兩種傳染病.目前,TGE和PED的診斷方法主要有病毒中和試驗、免疫熒光法、免疫電鏡法、ELISA和RT-PCR法等.隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展,ELISA和RT-PCR法以其敏感性高、特異性強越來越受到人們的重視.該研究所用TGEV和PEDV可在PK15細胞中大量增殖.在PK15細胞上分別培養(yǎng)TGEV和PEDV,待70％細胞出現(xiàn)CPE時收

2、毒.應用Reed-Muench法測得TGEV和PEDV的TCID<,50>.結(jié)果為:TGEV的TCID<,50>為10<'-4.8>/0.1mL.查反對數(shù)得63095,即該TGEV液63095倍稀釋液0.1mL等于1個TCID<,50>.PEDV的TCID<,50>為10<'-4.2>/0.1mL.查反對數(shù)得15849,即該PEDV液15849倍稀釋液0.1mL等于1個TCID<,50>.又在Genbank中查出豬傳染性胃腸炎病毒(TG

3、EV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的基因組序列,結(jié)合兩種病毒基因組結(jié)構特點,在對兩種病毒基因序列進行同源性比較的基礎上,選擇二者的S蛋白基因為引物設計區(qū).根據(jù)多重PCR引物設計原則,應用Primer5.0軟件設計了TGEV和PEDV各兩條引物.在此基礎上,經(jīng)PCR反應條件的優(yōu)化,建立了TGEV和PEDV的二聯(lián)RT-PCR,其最佳系統(tǒng)組成為,引物濃度:TGEV為0.6μmol/L,PEDV為0.4μmol/L;MgCl<,2>濃度為2m

4、mol/L,dNTP濃度為100μmol/L.最佳循環(huán)條件為:94℃1min→56℃ 50s→72℃ 1min,35個循環(huán),最后72℃延伸10min.該試驗建立的TGEV和PEDV的二聯(lián)RT-PCR可在同一反應中,同時擴增出這兩種病毒不同大小的兩個特異性核苷酸片段,以建立的二聯(lián)RT-PCR擴增其它對照病毒未見陽性反應.并確定該二聯(lián)RT-PCR可檢測TGEV6.3TCID<,50>的模板,PEDV15.8TCID<,50>的模板,比單項R