豬傳染性胸膜肺炎ELISA診斷方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是豬傳染性胸膜肺炎(Porcine Contagious pleuropneumonia)的致病菌,該病是一種呼吸道疾病,影響著全世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展.豬感染此病后會(huì)呈現(xiàn)從急性的突然死亡到慢性感染及亞臨床感染等癥狀.急性感染可表現(xiàn)為肺的纖維素性、出血性壞死,死亡率高;慢性感染的豬無明顯的臨床癥狀但生長(zhǎng)緩慢.發(fā)病后存活下來的豬可成為病原的攜帶者,從而可能

2、引起此病的再次爆發(fā).所以,豬群APP血清抗體的檢測(cè)對(duì)預(yù)防和控制該病的爆發(fā)具有十分重要的意義.迄今為止,已報(bào)道的APP血清型共有15種,不同血清型之間沒有或僅有弱的交叉反應(yīng),這給該病的診斷和預(yù)防帶來了很大的困難.傳統(tǒng)的血清學(xué)診斷方法,如CFT、IHA等,針對(duì)的是菌體抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體,只能對(duì)同血清型的APP做出檢測(cè).免疫預(yù)防也存在著同樣的問題,APP的滅活苗具有一定的保護(hù)力,但是,也只能對(duì)同血清型APP的感染產(chǎn)生保護(hù).該研究主要是針對(duì)以上

3、情況,旨在建立一種特異、敏感、能對(duì)所有血清型APP做出檢測(cè)的血清學(xué)檢測(cè)方法.由于胸膜肺炎放線桿菌的毒素和轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白具有種特異性,所以有希望用于APP診斷方法的建立.將含有豬胸膜肺炎放線桿菌毒素Ⅱ基因的質(zhì)粒pET-Apx Ⅱ轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3).挑選出表達(dá)量最高的克隆子,然后于37℃經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá).對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)包涵體進(jìn)行了變性和復(fù)性.用復(fù)性后的蛋白作抗原,建立了檢測(cè)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌抗體的間接酶聯(lián)免疫吸

4、附試驗(yàn)(ELISA).與間接血凝(IHA)檢測(cè)結(jié)果作了比較,證明所建立的ELISA診斷方法具有較高的特異性和敏感性,并具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性.利用建立的Apx Ⅱ-ELISA診斷方法對(duì)2503份臨床送檢的各地豬血清進(jìn)行檢測(cè),測(cè)得豬傳染性胸膜肺炎的陽(yáng)性率平均為63﹪以上.利用地方分離的APP血清型2型菌株,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,用PCR的方法擴(kuò)增了其轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白A基因(tbpA基因),擴(kuò)增片段的大小為2726bp,并克隆到pET-28b中構(gòu)建