豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌三價(jià)滅活疫苗的研制.pdf

1、山東9個(gè)地區(qū)11個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)，自2011年以來豬群陸續(xù)發(fā)病，疫情不斷，遭受了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了全面了解豬場(chǎng)的發(fā)病原因，從而有針對(duì)性地控制疫情，本研究對(duì)發(fā)病豬場(chǎng)送檢的264份病料進(jìn)行病原檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)病豬體內(nèi)存在的主要病原及其分離率分別為:豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)占43.18％，流行性腹瀉病毒(Epidemic diar

2、rhea virus，縮寫)占27.27％，豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）占31.64％;豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）占58.33％，副豬嗜血桿菌（Haemophilusparasuis，HPS）占26.42％，大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)占32.85％，支氣管敗血波氏桿菌(Bordetella bronchi

3、septica，Bb)占3.12％，綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)占2.51％。結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)呼吸道疾病的病原(PRRSV、APP和Bb)的總分離率最高，其中原發(fā)和繼發(fā)感染的APP分離率占主導(dǎo)地位，這可能是山東地區(qū)規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)病的主要原因之一。
　　為了研制一種有效的疫苗來防控APP的危害，本研究對(duì)從山東規(guī)?；i場(chǎng)送檢病料中分離到的24株APP的培養(yǎng)特性、血清型、分子生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，并根據(jù)

4、分離株毒力和免疫保護(hù)的相關(guān)結(jié)果，從中篩選出候選疫苗株。血清型鑒定結(jié)果表明，分離株的血清型分為1、2、5、7和10型，各有8、1、6、8、1株;其中血清1、5、7型分離株占總分離株的91.67％，因此，這三個(gè)血清型的菌株被用作疫苗株的參考。最終，根據(jù)致病性試驗(yàn)結(jié)果，分別從血清1、5、7型分離株中篩選出免疫原性好、毒力強(qiáng)的APPSD1101、APPSD1207、APPSD1103株作為生產(chǎn)用疫苗株，以制備豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌三價(jià)滅活疫苗

5、。
　　對(duì)篩選得到的三株疫苗株的最小致死量進(jìn)行了測(cè)定:每個(gè)疫苗株設(shè)置五個(gè)濃度組(2.0×109 CFU/ml、5.0×108 CFU/ml、2.0×108 CFU/ml、5.0×107 CFU/ml、2.0×107 CFU/ml)和空白對(duì)照組，共6組，每組接種5頭6周齡健康易感商品豬，每頭滴鼻攻毒3 ml。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APP血清1、5、7型的最小致死量分別為1.5×108 CFU、1.5×109 CFU、6.0×108CFU。結(jié)果為

6、疫苗的效力檢測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　為了摸索該三價(jià)疫苗的生產(chǎn)工藝，本研究測(cè)定疫苗株在體外培養(yǎng)的最佳收獲時(shí)間，并通過甲醛（甲醛濃度分為0.1％、0.2％、0.3％、0.4％4組）在不同時(shí)間段滅活抗原，篩選最佳滅活條件，對(duì)疫苗的最小抗原量和最小免疫量進(jìn)行測(cè)定;并對(duì)制備的疫苗進(jìn)行物理性狀、安全性以及免疫效力進(jìn)行了檢測(cè)。依據(jù)生長(zhǎng)曲線的結(jié)果表明，調(diào)整種子液OD600值到0.5，然后按照3.0％的劑加入新培養(yǎng)液，37℃，160 rpm培養(yǎng)5h

7、-7h時(shí)收獲抗原最佳，此時(shí)的代謝產(chǎn)物少，抗原含量高，疫苗更安全;依據(jù)抗原滅活試驗(yàn)結(jié)果，制定的在實(shí)際生產(chǎn)過程中疫苗滅活條件為甲醛濃度0.3％，37℃下160 rpm攪拌15 h;通過最小抗原量試驗(yàn)結(jié)果測(cè)得，疫苗中最小抗原量APP血清1、5、7型分別為為2×109CFU/ml、4×109 CFU/ml、1×109 CFU/ml，為實(shí)際生產(chǎn)過程中確定最低的抗原含量提供了參考依據(jù);通過最小免疫量試驗(yàn)（結(jié)果與最小抗原量試驗(yàn)結(jié)果相符），本研究制定的