一株傳染性胰腺壞死病毒基因組序列分析及反向遺傳操作系統(tǒng)的建立.pdf

1、傳染性胰腺壞死?。↖PN）是由傳染性胰腺壞死病毒（IPNV）引起的一種主要危害鮭鱒魚苗的高致死性疾病。自上世紀(jì)八十年代傳入中國至今仍沒有有效的防控藥物，而由于毒株存在變異及安全因素，國外商品化疫苗無法直接引進及應(yīng)用。本課題組于2013年IPN暴發(fā)期間在中國云南省某虹鱒養(yǎng)殖場分離到一株IPNV強毒（命名為ChRtm213）。本文對該毒株的全基因組序列進行了測定與分析，并在此基礎(chǔ)上利用反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建了重組IPNV病毒（rChRtm21

2、3）。本研究對全面了解IPNV的結(jié)構(gòu)與功能、揭示IPNV致病與免疫的分子機制等相關(guān)的研究具有重要意義。
　　本研究利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法，從IPNV-ChRtm213細(xì)胞培養(yǎng)物的總RNA中獲得了ChRtm213基因組片段并進行了序列測定，與GenBank中IPNV序列進行了比對，并運用軟件對其進行生物信息學(xué)分析。序列分析結(jié)果表明，ChRtm213毒株的全基因組序列包含一個A鏈（3099 bp）編碼多聚蛋白VP

3、2-VP4-VP3，和一個B鏈（2789 bp）編碼一個RNA依賴的RNA聚合酶VP1蛋白。系統(tǒng)發(fā)育分析表明， ChRtm213屬于基因1型，血清型為A9（Jasper），和日本IPNV毒株AM98具有最高的同源性，其中A鏈與B鏈相似性分別為96.3％和97.3%。
　　本研究通過In-Fusion無縫連接的方法成功構(gòu)建了以T7 RNA聚合酶介導(dǎo)的IPNV高效反向遺傳操作系統(tǒng)。分別在ChRtm213株A、B鏈上引入分子沉默性標(biāo)簽并

4、將其克隆在真核表達載體（ NDV vector）的T7啟動子下游，構(gòu)建了ChRtm213-NDV-A和 ChRtm213-NDV-B重組質(zhì)粒，然后通過LipofectamineTM2000（Invitrogen）介導(dǎo)，與表達T7RNA聚合酶的真核表達載體共轉(zhuǎn)染CHSE-214細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后96 h利用新的單層CHSE-214繼續(xù)擴增。通過噬斑純化鑒定、電鏡觀察、間接免疫熒光檢測、酶切分子標(biāo)簽檢測證明了重組IPNV的存在。本研究成功構(gòu)建了I