傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)VP092R的鑒定及功能研究.pdf

1、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)屬于虹彩病毒科(iridoviridae)腫大細胞病毒屬(Megalocytivirus)，是造成養(yǎng)殖鱖暴發(fā)性死亡的主要病原，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。本實驗室率先于2001年成功完成了ISKNV全基因組序列測定、ORF劃分和序列分析工作，為ISKNV基因進行更深入研究奠定了基礎。
　　 基于對ISKNV全基因組測序結果及生物信息學軟件預測結果分析，本論文選定線粒體相關病毒基因ORF09

2、2R進行功能研究。通過RACE技術成功獲得了該基因全長cDNA，確定其轉錄本位于ISKNV基因組的84394～85757bp處(全長1364bp)。使用ORF092R特異性RNA探針進行Northern blot分析，雜交得到一條與RACE結果大小一致的轉錄本。對ISKNV感染后ORF092R的轉錄時相分析表明，ORF092R作為一個早期基因在病毒感染的早期階段轉錄。使用自制的VP092R蛋白C端肽段抗體進行Western blot及細

3、胞免疫熒光實驗，證實了VP092R蛋白在病毒感染的細胞中表達。RACE、Northern blot以及Western blot等實驗結果證實該基因在ISKNV感染的細胞中轉錄及表達。
　　 借助激光共聚焦顯微鏡觀察及亞細胞組分分離方法，對該基因表達產(chǎn)物的亞細胞定位進行研究，實驗結果顯示VP092R蛋白為線粒體內(nèi)膜定位蛋白，其定位方向可能為N端朝向線粒體基質而C端朝向線粒體膜間隙。通過對其定位信號的研究我們發(fā)現(xiàn)，該蛋白不具有典型的

4、線粒體N端導肽序列，而跨膜區(qū)可能作為該蛋白內(nèi)部的定位信號序列對于線粒體定位具有重要作用。VP092R蛋白線粒體定位的研究結果為深入挖掘與之相互作用的蛋白及可能參與的功能提供了一定的研究思路和線索提示。
　　 通過GST Pull-down實驗，從斑馬魚線粒體鑒定出一個可與VP092R在體外特異性結合的蛋白，即線粒體熱休克蛋白70(mtHSP70)。mtHSP70，也叫Mortalin/PBP74/GRP75，是熱休克蛋白70家族

5、成員，其功能涉及腫瘤發(fā)生、細胞凋亡、抗原處理以及調(diào)節(jié)血糖反應等多個方面。隨后的免疫共沉淀實驗驗證VP092R與BHK細胞內(nèi)源性mtHSP70在體內(nèi)相互作用，推測二者的相互作用可能影響下游腫瘤抑制蛋白p53的轉錄活性和功能。VP092R相互作用蛋白研究為揭示該病毒蛋白對宿主細胞相關機能的影響，探索病毒感染與宿主相互作用的機制奠定了基礎。
　　 為研究該基因對細胞生理機能的影響，本論文篩選出穩(wěn)定表達VP092R蛋白的穩(wěn)定細胞系，進行