馬傳染性貧血病毒受體選擇剪接變異體的鑒定及功能性研究.pdf

1、病毒特異性的細(xì)胞受體是病毒入侵細(xì)胞的門戶，決定病毒的宿主范圍、組織及細(xì)胞嗜性。從受體角度闡明病毒入侵機(jī)制，是病毒性疾病的藥物研發(fā)及疫苗研制的重要方面。選擇性剪接可使同一基因編碼出功能不同蛋白，選擇性剪接對(duì)滿足生物體復(fù)雜性所需蛋白多樣性具有重要意義。鑒定不同選擇性剪接變異體的功能已成為生物學(xué)界研究的熱點(diǎn)。 馬傳染性貧血病毒(Equine infectiors anemia virus，EIAV)受體(ELRl)是2005年Zhan

2、g等通過(guò)克隆表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的，其屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)蛋白家族，本研究在原代培養(yǎng)的馬的單核巨噬細(xì)胞上克隆ELR1的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其mRNA基因序列存在選擇性剪接形式，即其cDNA序列除所報(bào)導(dǎo)的序列ELRl外，還存在插入序列ELRl-IN和缺失序列ELR1-DE，ELRl-IN在已公布的序列的786-787位之間插入153bp，ELR1-DE型序列缺失了所公布序列415-478位64bp。不論序列的插入還是缺失均導(dǎo)致編碼框的移位，而

3、產(chǎn)生截短的受體多肽片段。 為定量各種形式受體在體內(nèi)的表達(dá)比率，本研究建立了可以特異性檢測(cè)各種形式受體表達(dá)比率的SYBR Green　eal-time　RT-PCR方法。該方法通過(guò)在不同的位置設(shè)計(jì)引物來(lái)分別定量三種形式剪接體(ELR1+ELR1-IN+ELR1-DE)、兩種形式剪接體(ELR1+ELR1-IN)及插入型剪接體(ELR1-IN)的拷貝數(shù)，通過(guò)運(yùn)算就可以定量出每種剪接體的拷貝數(shù)并確定它們之間的表達(dá)比率。同時(shí)為減少實(shí)驗(yàn)誤

4、差，本研究?jī)H采用插入型序列質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品，每對(duì)引物均應(yīng)用這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)定量各自所擴(kuò)增基因的拷貝數(shù)，這樣就減少了標(biāo)準(zhǔn)品之間差異所造成的誤差。并通過(guò)比較了三對(duì)不同引物擴(kuò)增同一標(biāo)準(zhǔn)品的符合程度確定這種方法可行。應(yīng)用這種方法定量出每種形式受體的表達(dá)比率為ELRl-IN:ELRl-DE:ELRl=3:1.7:1。 為確定各種形式選擇性剪接變異體的蛋白表達(dá)形式，本研究將每種剪接變異體序列均連接到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建成真

5、核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞和Hela細(xì)胞.通過(guò)間接免疫熒光和Western-blot證明各種形式受體均可表達(dá)，膜結(jié)合型受體ELRl表達(dá)蛋白49ku，且均表達(dá)在細(xì)胞膜上，插入型受體ELRl-IN表達(dá)蛋白大小在38ku左右，以可溶性形式表達(dá)，缺失型序列ELRl-DE可以以第二個(gè)編碼區(qū)編碼蛋白，表達(dá)蛋白大小在36ku左右，表達(dá)在細(xì)胞膜上。 為研究可溶性受體的功能，本研究分別構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)膜結(jié)合型受體和穩(wěn)定表達(dá)插入型受體的293細(xì)胞系

6、，分別命名為293-ELRl和293-ELRl-IN，通過(guò)real-timeRT-PCR和RT酶活性檢測(cè)，結(jié)果表明393-ELR1細(xì)胞系可以支持EIAV的驢胎皮膚細(xì)胞弱毒FDDV毒株的進(jìn)入及復(fù)制，而對(duì)于293-ELR1-IN細(xì)胞系，推測(cè)僅可以支持病毒的進(jìn)入，并不能支持病毒的復(fù)制。將插入型序列的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293-ELRl細(xì)胞并以真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)及未轉(zhuǎn)染的空白293-ELR1細(xì)胞為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染后接種FDDV毒株并應(yīng)

7、用RT酶活性檢測(cè)病毒活性，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染插入型序列質(zhì)粒的受體組病毒活性明顯低于轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)及未轉(zhuǎn)染的空白293-ELR1細(xì)胞中病毒的活性，說(shuō)明插入型序列表達(dá)的可溶性受體可以明顯抑制FDDV毒株的感染表達(dá)膜結(jié)合型病毒受體的細(xì)胞系。 為進(jìn)一步研究病毒與受體相互作用的機(jī)制，針對(duì)病毒受體的特異性抗體是后期實(shí)驗(yàn)所必需的，故本實(shí)驗(yàn)又構(gòu)建了ELR1基因的完整編碼區(qū)及胞內(nèi)區(qū)的原核表達(dá)體系，并實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的表達(dá)，為