Tetherin和SAMHD1與馬傳染性貧血病毒相互作用的研究.pdf

1、馬傳染性貧血病毒(Equine Infectious Anemia Virus，EIAV)與人獲得性免疫缺陷病毒(HIV-1)同屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬，是開展慢病毒致病和免疫機(jī)制研究的重要?jiǎng)游锊《灸Ｐ?。慢病毒引發(fā)的疾病，嚴(yán)重威脅動物和人類健康，其中以HIV-1感染人引發(fā)的艾滋病最為嚴(yán)重和受到關(guān)注。疫苗是防控傳染病的重要手段，但慢病毒自身的抗原高度變異等特點(diǎn)，使其疫苗研究舉步維艱。特別對于HIV-1疫苗的研究，盡管世界各國已投入巨大人力

2、、物力，但仍未取得關(guān)鍵性突破。而在EIAV疫苗研究方面，二十世紀(jì)70年代，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的科研人員，通過馬、驢體及體外細(xì)胞（驢白細(xì)胞、驢胎皮膚細(xì)胞）傳代將EIAV強(qiáng)毒株馴化，成功獲得EIAV弱毒株。實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)地應(yīng)用證明，該弱毒株免疫馬屬動物后可誘導(dǎo)產(chǎn)生極強(qiáng)的免疫保護(hù)力。以該弱毒株作為疫苗在中國進(jìn)行的大范圍馬屬動物免疫接種，成功控制了EIA在中國的流行。而闡明該疫苗毒力弱化和誘導(dǎo)免疫保護(hù)的機(jī)制，有可能找到慢病毒誘導(dǎo)免疫保護(hù)

3、的關(guān)鍵因素，為HIV疫苗研制提供參考。
　　在探討EIAV疫苗弱化和誘導(dǎo)免疫保護(hù)機(jī)制的過程中，一個(gè)重要的科學(xué)問題是，為何通過異種動物或者體外細(xì)胞傳代會導(dǎo)致病毒致弱？長期以來科學(xué)界并未對該現(xiàn)象給出明確的機(jī)制闡述。已有研究表明，病毒侵入宿主會誘發(fā)宿主細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的先天性免疫反應(yīng)和繼發(fā)性免疫反應(yīng)。同時(shí)，在宿主細(xì)胞內(nèi)存在著許多天然免疫因子，當(dāng)病毒入侵時(shí)它們可以迅速反應(yīng)，直接或間接作用于病毒以抑制病毒的復(fù)制和傳播，進(jìn)而保護(hù)宿主抵御病毒感染。

4、目前，研究比較廣泛的宿主天然免疫限制因子有APOBEC3家族、TRIM家族、Tetherin/BST2、SAMHD1、MOV10等。這些限制因子可在病毒復(fù)制過程中的各階段通過各種不同機(jī)制直接或間接作用于病毒，抑制病毒的復(fù)制和傳播。EIAV弱毒疫苗的毒力弱化，主要發(fā)生在體外細(xì)胞的傳代培養(yǎng)過程中。由于該過程缺少宿主特異性免疫應(yīng)答的作用，推測宿主天然免疫應(yīng)答特別是細(xì)胞天然免疫限制因子可能在病毒毒力減弱過程中發(fā)揮重要作用。
　　為驗(yàn)證上述

5、假設(shè)，本研究選擇Tetherin和SAMHD1兩種限制因子，通過評價(jià)它們與EIAV的相互作用，尋找這兩種分子在EIAV致弱過程中的作用。本研究首先通過序列分析、蛋白結(jié)構(gòu)分析、細(xì)胞定位分析、蛋白表達(dá)分析、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、Western Blotting實(shí)驗(yàn)技術(shù)等方法比較了馬、驢Tetherin的基本生物學(xué)功能及抗病毒能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，馬Tetherin與驢Tetherin的氨基酸序列、分子拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、細(xì)胞定能及高級分子結(jié)構(gòu)都非常相似，但二者存在

6、個(gè)別氨基酸位點(diǎn)的變異，且這些氨基酸變異導(dǎo)致驢Tetherin限制EIAV病毒出芽的能力稍強(qiáng)于馬Tetherin。進(jìn)而又通過蛋白-蛋白相互作用等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，評價(jià)了驢Tetherin與不同進(jìn)化程度的EIAV毒株的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，驢Tetherin在限制不同進(jìn)化程度的EIAV毒株出芽的能力存在差異，病毒毒力越弱，Tetherin的限制作用越強(qiáng);EIAV強(qiáng)弱毒的Env基因具有一定的差異，但其均可拮抗驢Tetherin的限制作用，這種

7、拮抗作用隨病毒的致弱而變?nèi)?。在此基礎(chǔ)上，本研究對SAMHD1與EIAV的相互作用進(jìn)行了研究。先將人、馬SAMHD1進(jìn)行對比分析，并通過建立能穩(wěn)定表達(dá)馬SAMHD1基因的U937細(xì)胞系作為感染模型，然后將三質(zhì)粒系統(tǒng)包裝的假病毒(HIV-1、SIV、EIAV)感染上述構(gòu)建成功的穩(wěn)定表達(dá)馬SAMHD1基因的U937細(xì)胞系，以評價(jià)馬SAMHD1的抗病毒能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，馬SAMHD1具有與人SAMHD1相似的氨基酸序列及結(jié)構(gòu)，且具有廣譜抗逆轉(zhuǎn)

8、錄病毒的作用，而HD結(jié)構(gòu)域是其發(fā)揮抗病毒功能的主要功能域。最后，通過蛋白-蛋白相互作用等實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證了EIAV與馬SAMHD1的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EIAV可通過其自身編碼的Rev蛋白拮抗馬SAMHD1。且不同毒株的Rev拮抗馬SAMHD1的能力不同，即EIAV-Rev-LN拮抗馬SAMHD1的能力強(qiáng)于其他EIAV株Rev，提示EIAV-Rev拮抗馬SAMHD1的作用具有種屬差異，但EIAV-Rev拮抗馬SAMHD1的具體機(jī)制尚不清