單一受體的慢病毒——馬傳染性貧血病毒感染靶細(xì)胞的分子基礎(chǔ)研究.pdf

1、馬慢病毒受體1(Equine Lentivirus Receptor-1，ELR1)是Zhang等在2005年通過(guò)克隆表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的馬傳染性貧血病毒(Equine Infectious Anemia Virus，EIAV)的細(xì)胞受體，根據(jù)其序列特征將其歸屬于腫瘤壞死因子受體(Tumour necrosis Factor Receptor，TNFR)蛋白家族。與同為慢病毒的貓、猴和人免疫缺陷病毒利用兩個(gè)共同受體來(lái)感染細(xì)胞不同，ELR1是E

2、IAV感染靶細(xì)胞的單一功能性受體。為了進(jìn)一步闡述EIAV的致病機(jī)理，本文主要應(yīng)用蛋白結(jié)晶學(xué)方法，通過(guò)對(duì)與病毒結(jié)合的ELR1胞外區(qū)(ELR1-T)進(jìn)行體外原核表達(dá)和真核表達(dá)以及結(jié)晶試驗(yàn)，為該受體主要功能區(qū)蛋白質(zhì)晶體的X-射線衍射、蛋白結(jié)構(gòu)解析和結(jié)構(gòu)與功能研究打下了良好的基礎(chǔ)。本研究主要的結(jié)果如下：
　　 1、ELR1基因的序列分析：通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)的軟件分析，將ELR1基因的全序列分為信號(hào)肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。
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3、、ELR1表達(dá)載體的構(gòu)建：本研究將ELR1基因的胞外區(qū)(Truncated ELR1，ELR-T)克隆到表達(dá)載體pET-30 His-MBP上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET30-ELR1-T。經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定后，將pET30-ELR1-T質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)重組ELR1-T蛋白。
　　 3、表達(dá)系統(tǒng)的選擇：首先試用原核表達(dá)系統(tǒng)，以ELR1-T與His-MBP融合雙標(biāo)簽融合形式，表達(dá)該重組蛋白。經(jīng)SDS-PA

4、GE電泳檢測(cè)，雖然檢測(cè)出與雙標(biāo)簽His-MBP融合的重組ELR1-T蛋白有表達(dá)，但將該融合蛋白的His-MBP雙標(biāo)簽切除后，蛋白發(fā)生沉淀。之后嘗試了真核表達(dá)系統(tǒng)中的昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白，分別進(jìn)行了胞內(nèi)表達(dá)和胞外分泌表達(dá)。
　　 4、重組ELR1-T蛋白的純化：經(jīng)昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)得到的蛋白上清經(jīng)AmiconStirred Cell攪拌式超濾裝置系統(tǒng)進(jìn)行樣品的前期濃縮處理，將處理后的上清經(jīng)過(guò)高親和Ni-NTA

5、 Resin初步純化，再采用凝膠過(guò)濾層析方法進(jìn)行純化。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，純化后的ELR1-T蛋白呈單一條帶，即已高純化，可用于結(jié)晶試驗(yàn)。
　　 5、重組ELR1-T蛋白的晶體生長(zhǎng)研究：采用氣相擴(kuò)散法進(jìn)行晶體的篩選，在Hampton Research公司的Crystal Screen2的31＃、39＃、44＃和Index的52＃條件下生長(zhǎng)出微晶體，這為最終獲得高質(zhì)量晶體，應(yīng)用X-射線衍射進(jìn)行ELR1蛋白的三維構(gòu)象分析，奠