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1、干擾素(IFN)是在特定的誘生劑作用下由細(xì)胞產(chǎn)生的一組具有抗病毒、抗腫瘤、參與免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性的糖蛋白,分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三大類型。其中,Ⅰ型干擾素的抗病毒作用最強(qiáng),對(duì)人類和動(dòng)物病毒病的免疫防治等相關(guān)基礎(chǔ)性研究具有重要意義,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景.基因工程干擾素不僅與天然干擾素有高度相似的生物學(xué)活性,并且與傳統(tǒng)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生干擾素相比,還有純度高、適合規(guī)?;a(chǎn)、產(chǎn)品質(zhì)量容易控制、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),更重要的是通過大規(guī)模生產(chǎn)的基因
2、工程干擾素的成本大大降低,利于其在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用。本研究的目的就是利用基因工程技術(shù)和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制出重組雞、鴨和犬α干擾素并研究其抗病毒功能,為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
根據(jù)GeneBank上登錄的雞、鴨和犬α干擾素基因序列,去掉信號(hào)肽,保留編碼成熟蛋白的序列,按照大腸桿菌密碼子的偏好性及密碼子的兼并性,在不改變氨基酸組成和排列順序的基礎(chǔ)上,對(duì)已知的基因序列進(jìn)行改造,全部替換為大腸桿菌喜好的密碼子,得到新
3、的編碼雞、鴨和犬α干擾素的基因序列,大小分別為489bp、486bp、495bp,并在序列兩端分別加上EcoRI、XhoI酶切位點(diǎn),送生物公司進(jìn)行全基因合成,并連入原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a中,得到pET32a-ChIFN-α、pET32a-DuIFN-α和pET32a-CaIFN-α三個(gè)重組原核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)熱轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中,加IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳顯示,三個(gè)重組原核表達(dá)質(zhì)粒均在大腸桿菌BL21(D
4、E3)中進(jìn)行了高水平表達(dá),得到三個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量均約為32kD的干擾素融合蛋白,并以包涵體形式存在。經(jīng)細(xì)胞破碎、包涵體提取、洗滌、溶解變性及透析復(fù)性后得到較純的重組雞、鴨和犬α干擾素.
利用微量細(xì)胞病變抑制法測(cè)定重組融合蛋白的抗病毒活性,結(jié)果如下:(1)利用雞胚成纖維細(xì)胞測(cè)定,重組雞α干擾素抗VSV活性為5.6x104U/mL,蛋白濃度為0.53mg/mL,比活性為1.06x105U/mg;抗NDV活性為1.35x105U/
5、mL,比活性為2.55x105U/mg。(2)利用鴨胚成纖維細(xì)胞測(cè)定,重組鴨α干擾素抗VSV活性為5.13×103U/mL,蛋白濃度為0.92 mg/mL,比活性為5.6x103U/mg。(3)利用MDCK細(xì)胞測(cè)定,重組犬α干擾素抗VSV活性為1.06x107U/mL,蛋白濃度為0.79 mg/mL,比活性為1.67x107 U/mg。
對(duì)試驗(yàn)雞進(jìn)行新城疫人工感染的干擾素預(yù)防和治療試驗(yàn),試驗(yàn)雞分成4組,1、2組分別于攻毒前
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