重組雞α干擾素全基因合成、原核表達(dá)及抗病毒活性測(cè)定.pdf

1、干擾素(Interferon，IFN)是在病毒感染的情況下，機(jī)體細(xì)胞所產(chǎn)生的一類多功能蛋白，進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)全身，細(xì)胞內(nèi)的抗病毒作用機(jī)制被激活合成各種抗病毒蛋白以抵抗病毒的侵?jǐn)_。目前一些禽類病毒性傳染疾病仍然缺乏有效的防治手段，化學(xué)藥物的使用容易產(chǎn)生耐藥性，引起禽類體內(nèi)藥物殘留而影響人類健康，疫苗的研制則需要考慮病毒的變異與多樣性。與疫苗和化學(xué)藥物相比，雞源干擾素具有廣譜、高效和無殘留等優(yōu)點(diǎn)，可有效的用于雞病毒性傳染病的預(yù)防與治療。目前

2、我國(guó)已有用于臨床使用的雞IFN-α，但仍然存在著表達(dá)量低、純度不高和復(fù)性工藝復(fù)雜等問題，因此，本研究利用基因工程技術(shù)與蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制重組雞IFN-α，優(yōu)化其表達(dá)、純化和復(fù)性方法，并研究其抗病毒活性，旨在為雞IFN-α工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　根據(jù)GenBank上登錄的雞IFN-α的基因序列，除去信號(hào)肽部分，保留編碼成熟蛋白的基因序列。在不改變氨基酸的條件下，按照大腸桿菌對(duì)密碼子的偏愛性，利用在線分析軟件檢測(cè)其中所包含

3、的稀有密碼子，替換為大腸桿菌偏愛的密碼子并初步預(yù)測(cè)雞IFN-α的表達(dá)水平。將優(yōu)化的基因連接到PUC57載體上并進(jìn)行全基因合成。重組質(zhì)粒PUC57-ChIFN-α與表達(dá)載體pET32a連接，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21細(xì)胞中。對(duì)重組雞IFN-α成熟蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度和溫度條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)洗滌、變性、純化和復(fù)性，獲得了重組雞IFN-α。利用微量細(xì)胞病變抑制法測(cè)定重組雞IFN-α的抗病毒活性。經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果顯示，重組雞IF

4、N-α在37℃，0.6mmol/mL的IPTG條件下，以包涵體的形式高效表達(dá)，目的蛋白表達(dá)量占總蛋白的28.9％，蛋白分子量約為32kD。經(jīng)300mM咪唑洗脫純化的目的蛋白，稀釋與透析法相結(jié)合復(fù)性后，獲得了純度為95％的重組雞IFN-α。經(jīng)Western blot鑒定，重組蛋白與抗體之間，具有較好的反應(yīng)原性，表明分子質(zhì)量為32kD的蛋白即為目的蛋白。在雞成纖維細(xì)胞上，重組雞IFN-α抗VSV的活性為1.19×105U/mL，蛋白濃度為0