豬α-干擾素基因的原核表達及活性分析.pdf

1、病毒性傳染病是困擾我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展最突出的問題，每年因病毒感染引起豬死亡和生長障礙造成了巨大的經(jīng)濟損失。干擾素(interferon,IFN)是由機體細胞產生的一類高活性多功能糖蛋白，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤活性及免疫調節(jié)等多種功能。其中又以α-干擾素的廣譜抗病毒作用最為顯著，利用基因工程技術獲得具有生物學活性的重組豬α-干擾素對豬病毒病的防治具有重要的意義。本研究在克隆豬α-干擾素基因的基礎上，在大腸桿菌和枯草桿菌兩種原核表達系統(tǒng)中分別進

2、行了豬α-干擾素的表達，并分析了重組表達產物的活性，獲得如下主要結果： 1)根據(jù)GenBank上豬α-干擾素基因序列(M28623)，設計了一對克隆引物5Pinf和3Pinf,以長白豬肝臟基因組為模板，采用PCR方法擴增得到了豬α-干擾素全長基因片段，并將其與克隆載體連接，獲得重組克隆質粒pGEM-PoIFN<,α>測序結果表明，豬Q.干擾素基因全長681bp，其中開放閱讀框架長570bp(51-620)，編碼189個氨基酸殘基

3、，N端前23個氨基酸殘基為信號肽序列，干擾素成熟肽由166個氨基酸組成，理論分子量為19.0kDa。 2)設計了一對用于豬Q干擾素原核表達的引物5Eifn和3Eifn，并分別引入了EcoRI和NotI酶切位點，以重組質粒pGEM-PoIFN為模板，對豬Q.干擾素基因進行亞克隆，并將其定向插入融合表達載體pET-30a，經(jīng)轉化和篩選獲得了含重組表達質粒pET-PolFNa的基因工程菌E.coli[pET-PoIFN]。SDS-PA

4、GE蛋白質電泳顯示，重組豬α-干擾素基因以包涵體形式表達，目的蛋白大小約為24 kDa，與融合表達產物的理論分子量接近。ELISA分析顯示，重組豬α-干擾素可與小鼠抗豬α-干擾素單克隆抗體結合，這進一步證實了豬α-干擾素基因在大腸桿菌中成功表達。 3)設計了一對用于豬α-干擾素基因在枯草桿菌中表達的引物5Bifn和3Bifn，并分別引入了SalI和Xba I酶切位點，對豬α-干擾素基因亞克隆并定向插入表達載體pBESl，經(jīng)轉化和