鴨α干擾素原（真）核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究.pdf

1、本文對(duì)四川省內(nèi)地方品種四川麻鴨的干擾素進(jìn)行如下系列研究：對(duì)四川麻鴨Ⅰ型干擾素基因IFN-αORF進(jìn)行克隆、鑒定和序列分析；構(gòu)建IFN-αORF基因原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體；IFN-α原核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究；利用雛鴨為模型，應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究pcDNA-SDIFN-α真核表達(dá)質(zhì)粒在鴨體內(nèi)的動(dòng)態(tài)表達(dá)分布規(guī)律；同時(shí)對(duì)作為免疫佐劑的pcDNA-SDIFN-α真核表達(dá)質(zhì)粒免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行研究，獲得以下結(jié)果： 1.四川麻鴨IFN

2、-αORF基因克隆、序列比對(duì)分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)了兩對(duì)加入EcoRI和BamHI兩個(gè)酶切位點(diǎn)的特異性引物對(duì)，采用PCR和nest-PCR的方法，從鴨肝臟組織基因組DNA擴(kuò)增得到大小兩個(gè)完全包含麻鴨α干擾素ORF基因的DNA片段。其中小片段更適合用于表達(dá)，并將其進(jìn)行pGEM-T載體克隆與測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果采用ClustalX軟件進(jìn)行序列分析以及與北京鴨、雞、鵝等NCBI上序列進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示四川麻鴨與

3、北京鴨ORF基因序列十分相似，其核苷酸同源性達(dá)到99.13％，氨基酸同源性為98.96％。與雞的核苷酸及氨基酸同源性分別為71.8％、49.97-50.47％，與鵝的核苷酸同源性為96％。同時(shí)用BioEdit、NetNGlyc、TreeView軟件對(duì)該基因所推測(cè)的蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果表明四川麻鴨有2個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，1個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(ProteinkinaseCphosphorylation)和1個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)(Cas

4、einkinaseⅡphosphorylationsite)，信號(hào)肽切割位點(diǎn)28-29位ANA和FS氨基酸之間，成熟的鴨α干擾素有5個(gè)疏水區(qū)，無(wú)跨膜區(qū)。 2.SDIFN-αORF基因原核表達(dá)載體pBV220-SDIFN-α的構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物的抗病毒活性 采用BamHI和EcoRI酶切，通過定向粘末段連接法，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pBV220-SDIFN-α質(zhì)粒。并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)菌株DH5α中進(jìn)行表達(dá)，采用溫度誘導(dǎo)的方式，

5、對(duì)誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。結(jié)果顯示工程菌進(jìn)行了表達(dá)，產(chǎn)生的包涵體蛋白分子量為40KD左右。對(duì)純化后的包涵體采用稀釋復(fù)性的方法復(fù)性，采用VSV/DEF系統(tǒng)初步檢測(cè)抗病毒活性，干擾素的抗病毒活性約為150U/ml，比活力為440U/mg。應(yīng)用FQ-PCR檢測(cè)方法，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)抑制DHBV和體外抑制DPV病毒核酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)的干擾素具有強(qiáng)烈的病毒復(fù)制抑制作用，具有明顯的生物學(xué)活性。 3.SDIFN-αORF基因真核表

6、達(dá)載體pcDNA-SDIFN-α的構(gòu)建及鑒定 利用合成在引物兩端的EcoRI、BamHI酶切位點(diǎn)，將目的基因成功地從pGEM-T載體克隆重組體中切下，并通過粘端連接的方法，連接到pUC18定向位置上，然后用EcoRI和XbaI雙酶切真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和pUC18-SDIFN-α，實(shí)現(xiàn)了SDIFN-α定向克隆到pcDNA3.1(+)載體上。四川麻鴨IFN-α真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α經(jīng)BamHI、E

7、coRI和XbaI三種酶切驗(yàn)證，并測(cè)序證明四川麻鴨IFN-α的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α構(gòu)建正確。 4.免疫組織化學(xué)檢測(cè)真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α在鴨體內(nèi)表達(dá)方法的建立及動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律的研究 以pcDNA-SDIFN-α真核質(zhì)粒免疫鴨，分時(shí)間段采集鴨16種不同組織，建立了免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法，并應(yīng)用該方法檢測(cè)干擾素在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律。pcDNA-SDIFN-α免疫鴨后，持續(xù)表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)9周。能在肺

8、臟細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、腸腺和腸絨毛細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、皮膚內(nèi)檢測(cè)到表達(dá)產(chǎn)物，在14d-35d進(jìn)行了高峰表達(dá)。胸腺、胰腺、法氏囊和哈德氏腺未檢測(cè)到陽(yáng)性黃色顆粒，肺臟、免疫部位最早出現(xiàn)陽(yáng)性顆粒，腦組織細(xì)胞中陽(yáng)性顆粒數(shù)量隨時(shí)間變化較小。其中基因槍免疫鴨后，各組織中的含量和表達(dá)量呈現(xiàn)的總體規(guī)律為6μg組＞3μg組＞1μg組。肌肉注射免疫鴨后，各組織中的含量和表達(dá)量呈現(xiàn)的總體規(guī)律為200μg組＞100μg組＞50μg組，都具有一定的劑量相

9、關(guān)性?；驑屴Z擊法較肌肉注射法IFN-α基因表達(dá)出現(xiàn)的時(shí)間早，3h就可以檢測(cè)到表達(dá)產(chǎn)物。同時(shí)，相對(duì)于肌肉注射法免疫，基因槍轟擊法所用的表達(dá)質(zhì)粒用量更少。 5.真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-SDIFN-α在鴨體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)劑活性的初步研究 以pcDNA-SDIFN-α真核表達(dá)質(zhì)粒為免疫調(diào)節(jié)劑，研究對(duì)DPV/DVH弱毒苗免疫活性調(diào)節(jié)作用。分不同時(shí)間段采血，采用MTT法測(cè)定鴨外周血T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化效果、CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化和特異性