雞α干擾素基因克隆、原核表達(dá)及抗病毒活性研究.pdf

1、家禽傳染性疾病是養(yǎng)禽業(yè)最大的威脅，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。干擾素(IFN)是一類(lèi)重要的細(xì)胞因子，具種屬特異性，具有廣譜的抗病毒、抗細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。因此研發(fā)具有廣譜抗病毒作用的雞干擾素具有重大的意義。 參照GenBank上登陸的雞α干擾素基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，應(yīng)用PCR技術(shù)直接從河南大面積飼養(yǎng)的羅曼雞、海蘭雞及地方品種固始雞肝組織基因組DNA中擴(kuò)增雞α干擾素基因。將擴(kuò)增得到的特異性片段克隆入pGEM-TEasy

2、載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，運(yùn)用藍(lán)白斑篩選、質(zhì)粒PCR鑒定及酶切鑒定篩選陽(yáng)性可疑菌株，并將篩選的陽(yáng)性菌株送往大連寶生物測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，得到了上述3個(gè)品種雞α干擾素基因，大小均為582bp，除去93個(gè)信號(hào)肽，共編碼162個(gè)氨基酸。用DNAstar序列分析軟件對(duì)其進(jìn)行同源性分析，核苷酸同源性均在99.3％以上，氨基酸同源性均在97.9％以上。 在此基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)一對(duì)引物，從pGEM-TEasy載體中擴(kuò)增雞α干擾素成熟肽蛋

3、白基因用SphⅠ和SalⅠ雙酶切后，再將其插入同樣經(jīng)SphⅠ和SalⅠ雙酶切的原核表達(dá)載體pQE30中，構(gòu)建了雞α干擾素原核表達(dá)載體pQEIFN-α。轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，經(jīng)PCR、酶切鑒定并進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明，將ChIFN-α成熟肽蛋白基因正確地插入到原核表達(dá)載體pQE30的目的位點(diǎn)，重組質(zhì)粒pQEIFN-α轉(zhuǎn)化受體菌M15后用IPTG誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了雞α干擾素在大腸桿菌M15中的表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳后在約20.0

4、Ku處出現(xiàn)了特異性條帶，用1.0mmoL/LIPTG于37℃誘導(dǎo)8h表達(dá)產(chǎn)物最佳，用鼠抗雞IFN-α單克隆抗體作一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體作二抗，Westernblotting檢測(cè)出現(xiàn)了特異性的條帶。表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，包涵體經(jīng)變性、復(fù)性處理后，用細(xì)胞病變抑制法測(cè)定活性，結(jié)果表明重組雞α干擾素在Vero細(xì)胞上抗VSV的病毒活性為1.16×103U/mg。 與人和哺乳動(dòng)物比較，雞IFN-α的研究相對(duì)來(lái)說(shuō)比較滯后。本