獅頭鵝干擾素基因的克隆及重組α-干擾素的抗病毒活性.pdf

1、干擾素(interferons，IFNs)屬于細(xì)胞因子家族，具有諸如抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)作用等廣泛的生物學(xué)活性。目前，商品化的干擾素制品已逐漸在動(dòng)物生產(chǎn)和獸醫(yī)臨床中應(yīng)用。 本研究從獅頭鵝外周血細(xì)胞中提取基因組DNA，采用巢式PCR方法擴(kuò)增獅頭鵝α-干擾素基因片段(GoIFN-α)；及從ConA刺激的培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞提取總RNA，采用RT-PCR方法擴(kuò)增獅頭鵝γ-干擾素基因cDNA片段(GoIFN-γ)，將擴(kuò)增片段分別克隆

2、到pGEM-T載體(pGEM-T-GoIFN-α/γ)并進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明，GoIFN-α基因全長(zhǎng)576bp，編碼191個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，分析其與其它品種家禽IFN-α的核苷酸序列同源性介于41.2％～98.3％之間，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為13.0％～96.4％；GoIFN-γ基因的cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)495bp，編碼164個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，分析其與其它品種家禽的IFN-γ核苷酸序列同源性介于82.4％～99.6％之

3、間，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為66.7％～98.8％；結(jié)果表明不同品種鵝間的干擾素具有極為相似的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；同時(shí)親緣關(guān)系越近的物種同源性就越高，不同物種在進(jìn)化過程中的變化較大。 采用PCR方法從重組質(zhì)粒pGEM-T-GoIFN-α中擴(kuò)增到GoIFN-α基因成熟肽基因編碼序列，將成熟肽編碼序列亞克隆至表達(dá)載體pET32a(+)，成功構(gòu)建原核融合表達(dá)質(zhì)粒pET32a-rGoIFN-α。重組質(zhì)粒pET32a-rGoIFN-α轉(zhuǎn)化表達(dá)

4、菌種BL21，采用IPTG誘導(dǎo)，收獲菌體裂解后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)在36KDa有一條特異的重組獅頭鵝α-干擾素融合蛋白(rGoIFN-α)條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相同。試驗(yàn)優(yōu)化rGoIFN-α表達(dá)條件，結(jié)果表明rGoIFN-α在30℃IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4h的目的蛋白表達(dá)量最高。經(jīng)過不同IPTG濃度、不同溫度誘導(dǎo)表達(dá)的rGoIFN-α的可溶性分析后，結(jié)果表明rGoIFN-α主要以包涵體的形式存在。采用溶菌酶和超聲波裂解、4mol/L尿素

5、洗滌、8mol/L尿素溶解、超濾純化和復(fù)性，得到純度較高的rGoIFN-α。融合蛋白經(jīng)過腸激酶酶切、鎳離子柱親和純化、透析濃縮得到獅頭鵝α-干擾素蛋白。純化后的蛋白用于獅頭鵝α-干擾素抗病毒活性的研究。rGoIFN-α經(jīng)過Westernblot分析，在硝酸纖維素膜上檢測(cè)到分子大小約為36KDa的特異性蛋白條帶，表明rGoIFN-α能與抗體進(jìn)行特異性反應(yīng)。 采用微量中和試驗(yàn)評(píng)價(jià)了rGoIFN-α的抗病毒活性。制備雞胚成纖維細(xì)胞，采

6、用TCID50法測(cè)定NDVRoakin病毒株的雞胚成纖維細(xì)胞半數(shù)感染量。試驗(yàn)結(jié)果表明，NDVRoakin病毒株的TCID50是10-4.5465。成纖維細(xì)胞病變抑制試驗(yàn)檢測(cè)rGoIFN-α抗病毒活性。結(jié)果表明，在50TCID50攻毒時(shí)rGoIFN-α處理的雞胚成纖維細(xì)胞，rGoIFN-α能夠抑制NDVRoakin病毒在雞胚成纖維細(xì)胞中復(fù)制，復(fù)性后純化的rGoIFN-α(rGoIFN-α)的抗病毒活性達(dá)1.42×104U/mg；酶切后rG