家兔γ干擾素原核表達、抗病毒活性以及單克隆抗體的研究.pdf

1、干擾素是人和其他動物機體內非常重要的一種細胞因子，在特定誘導劑的作用下，由效應細胞產生并分泌，具有廣譜抗病毒活性、抗腫瘤活性和調節(jié)免疫功能。按照國際通用的分類標準，干擾素主要分為三大類，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，IFN-γ屬于Ⅱ型干擾素，而且Ⅱ型干擾素只包含IFN-γ一個成員。IFN-γ是由CD4+Th1、CD8+T細胞以及NK細胞受特異或非特異性抗原刺激后產生的糖蛋白，天然形式為N-糖基化的同源二聚體，具有一定的種屬特異性。IFN-γ

2、除了具有抗病毒活性之外，還參與免疫調節(jié)和MHC（主要組織相容性復合體）抗原的表達，也可以控制細胞生長。
　　利用基因工程技術表達的干擾素與天然干擾素不僅在生物學活性方面高度相似，并且還具有純度高、產量大、同批次產物質量穩(wěn)定一致、適合規(guī)?；I(yè)化生產等優(yōu)點;更加重要的是，通過基因工程技術大規(guī)模生產干擾素能夠大大降低經(jīng)濟成本，這一點對于在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中大面積推廣應用干擾素非常有利。本研究中，利用基因工程技術、分子生物學技術、蛋白組學技術

3、等相關技術獲得重組兔γ干擾素，研究其抗病毒功能以及制備單克隆抗體，為兔γ干擾素工業(yè)化生產以及臨床應用奠定基礎。
　　利用RT-PCR技術從ConA刺激后的家兔外周血淋巴細胞中擴增兔γ干擾素（IFN-γ）基因，獲得大小約為504bp左右的目的片段。然后將其克隆、轉化入pET-28a(+)原核表達載體上，構建重組載體pET-28a-IFN-γ。將重組載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)過IPTG誘導、HisTrap親和柱純化獲得大小

4、約為18KDa左右的IFN-γ重組蛋白。
　　大量表達重組兔IFN-γ蛋白，然后進行蛋白復性，從而獲得有活性的IFN-γ蛋白。利用微量細胞病變抑制法測定重組兔IFN-γ蛋白的抗病毒效果。結果如下:(1)利用VERO細胞進行測定，重組兔IFN-γ蛋白抗VSV活性為2.51×103U/mL，蛋白濃度為0.556mg/mL，比活性是4.51×103U/mg。(2)利用MDCK細胞進行測定，重組兔IFN-γ蛋白抗VSV活性為3.98×10

5、3U/mL，蛋白濃度為0.556mg/mL，比活性是7.16×103U/mg。結果表明，重組兔IFN-γ可以在體外抑制VSV對細胞的毒害作用。
　　用純化的重組兔IFN-γ蛋白免疫BALB/c小鼠，制備脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，經(jīng)過篩選和克隆化，共獲得4株能穩(wěn)定分泌兔IFN-γ單克隆抗體(mAbs)的雜交瘤細胞株，分別被命名為3H8、4G4、4F10、6C12，亞型分別為IgG1、κ鏈，IgG2b、κ鏈，IgG1、κ