貓干擾素Omega基因的克隆、可溶性表達(dá)及抗病毒活性研究.pdf

1、貓omega型干擾素(FeIFN-ω)是一類(lèi)具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫增強(qiáng)作用的細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)首先從被病毒感染的死亡家貓脾臟中提取總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR的方法克隆出家貓干擾素ω型基因，然后將所擴(kuò)增出來(lái)的基因去除信號(hào)肽區(qū)，只保留成熟蛋白區(qū)基因，重新設(shè)計(jì)含有BamHI和NheI酶切位點(diǎn)的一對(duì)特異性引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，所得到的PCR產(chǎn)物純化回收后，經(jīng)BamHI和NheI雙酶切，插入含有麥芽糖分泌結(jié)合蛋白(MBP)的pMBP-P表達(dá)

2、載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10F'感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素(Amp)的LB平板，篩選陽(yáng)性克隆，并對(duì)重組子進(jìn)行BamHI和NheI雙酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序鑒定。鑒定后的重組基因工程菌株，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示目的蛋白以可溶形式在細(xì)胞周質(zhì)空間中得以表達(dá)。隨后，采用Ni-NTA親和層析純化FeIFN-ω，再經(jīng)SDS-PAGE電泳和WesternBlot檢測(cè)，分析純化的重組蛋白。最后采用貓腎上皮細(xì)胞(CRFK)-

3、濾泡性口炎病毒(VSV)系統(tǒng)按照細(xì)胞病變抑制法測(cè)定FeIFN-ω的抗病毒效價(jià)(TCID50)。 結(jié)果表明，本研究成功克隆了貓omega型干擾素基因，其全長(zhǎng)591bp，編碼196個(gè)氨基酸序列，其中1-23位氨基酸為信號(hào)肽區(qū)，24-196位氨基酸為成熟蛋白區(qū)。缺少信號(hào)肽的基因序列全長(zhǎng)519bp，編碼173個(gè)氨基酸。所構(gòu)建的質(zhì)粒pMBP-P/FeIFN-ω在大腸桿菌TOP10F'基因工程菌的細(xì)胞周質(zhì)空間中以可溶形式成功表達(dá)了分子量約為