豬α干擾素、豬β干擾素與豬γ干擾素的抗病毒活性及其免疫佐劑的研究.pdf

1、干擾素(IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫功能的細(xì)胞因子。自1957年Isaaes和Lindenmann首先發(fā)現(xiàn)干擾素(IFN)以來，人們對IFN韻研究、開發(fā)及應(yīng)用從未停止過，目前IFN已被廣泛應(yīng)用于人醫(yī)臨床多種疾病的治療。1980年WHO根據(jù)IFN抗原特異性的不同將其分為三類：IFN-α、IFN-β、IFN-γ；后來又依IFN作用的受體不同而分為兩型：Ⅰ型IFN和Ⅱ型IFN，Ⅰ型包括IFN-α、β、w、τ、δ等；Ⅱ型只有I

2、FN-γ。 相對而言，獸醫(yī)界對動物干擾素的研究起步較晚。由病毒、細(xì)菌等病原微生物侵染動物所引起的各種傳染性疾病嚴(yán)重制約了各個(gè)國家和地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，同時(shí)也對人類健康存在著巨大隱患。因此，研究動物干擾素對動物傳染性疾病的防治措施研究具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會意義。鑒于此，本研究以豬干擾素alpha(PoIFN-α)、豬干擾素beta(PolFN-β)與豬干擾素gamma(PolFN-γ)為研究對象，開展了這三種細(xì)胞因子對PRV、

3、PRRSV、FMDV抗病毒活性的研究，及其以蛋白或基因形式對豬瘟疫苗的佐劑效應(yīng)的研究。主要研究內(nèi)容包括： 1、PolFN-γ基因的克隆、測序分析及其原核表達(dá) 以刀豆素A(ConA)誘導(dǎo)的梅山豬外周血淋巴細(xì)胞中提取的總RNA為模板，采用RT-PCR方法克隆擴(kuò)增出全長豬丫干擾素基因(PoIFNγ，501bp)。經(jīng)測序結(jié)果證實(shí)擴(kuò)增得到的PoIFNγ與Genbank上所報(bào)道的豬γ干擾素基因同源性為100％；與羊、鹿、駱駝、牛、馬

4、、兔、人、鼠的氨基酸序列同源性分別78％、77％～80％、79％～80％、77％、71％、60％、59％～60％、43％。將PoIFNγ插入pGEX-KG表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化宿主菌BL<,21>，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，得到高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，證明PoIFN-γ與GST融合表達(dá)，主要形成不溶性包涵體，經(jīng)GelExpert軟件分析確定不可溶性融合蛋白約占總蛋白的69.91％，可溶性蛋白占15.64％，大小約為43 kDa。通過

5、對宿主菌不同時(shí)間的誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)目的蛋白在誘導(dǎo)后5小時(shí)的表達(dá)量最高，可達(dá)0.86 mg/mL。將表達(dá)產(chǎn)物變性、復(fù)性、透析、純化處理后加入牛腎細(xì)胞 (MDBK) 上，用水泡性口炎病毒(VSV)攻毒，測出重組的PoIFNγ具有較高的抗病毒作用，生物活性達(dá)到1.0×10<'5>U/mg。 2、PoIFN-α、PoIFN-β和PoIFN-γ的酵母分泌表達(dá)及PoIFN-β對FMDV的抑制作用 為了獲得高效分泌表達(dá)的重組豬α、β、γ干擾素

6、，利用基因工程技術(shù)，分別將編碼梅山豬α、β、γ干擾素成熟蛋白基因(mPoIFNα/β/γ，501/498/435 bp)，亞克隆到含分泌信號肽序列的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC 9K中，構(gòu)建成分泌型重組表達(dá)載體pPIC 9K-mPoIFNα/β/γ。用化學(xué)方法(LiCl)，將線性化的mPoIFNα/β/γ與ssDNA共轉(zhuǎn)化入畢赤酵母菌株GS115，轉(zhuǎn)化子經(jīng)MD平板篩選租PCR鑒定后，得到的陽性菌株再以高濃度的G418篩選到多拷貝重組子。該高

7、拷貝菌株經(jīng)1％甲醇連續(xù)誘導(dǎo)4天，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測，結(jié)果表明在畢赤酵母中豬α、β、γ干擾素獲得分泌型表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行理化分析及細(xì)胞病變抑制法(CPE<,50>)測定結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物具有較高的抗病毒生物活性。此外，酵母表達(dá)的PoIFN-β對口蹄疫病毒在IBRS-2細(xì)胞中的增殖也有明顯的抑制作用。 3、豬α、β、γ干擾素在不同細(xì)胞系中的表達(dá)及其單獨(dú)或聯(lián)合作用對PRV增殖的抑制效果的比較

8、 分別構(gòu)建3種真核表達(dá)質(zhì)粒：pcDNA-PoIFNα(pcD-PoIFNα)、pcDNA-PoIFNβ(pcD-PoIFNβ)與pcDNA-PoIFNγ(pcD-PoIFNγ)，分別轉(zhuǎn)染HeLa、MDBK、BHK-21、PK-15及IBRS-2細(xì)胞。于轉(zhuǎn)染后6、24、48、72小時(shí)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中的抗病毒活性(MDBK/VSV)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在五種細(xì)胞中干擾素的表達(dá)量均在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)達(dá)到高峰。轉(zhuǎn)染了pcD-PoIFNα的PK-15

9、，IBRS-2和BHK-21細(xì)胞是同樣轉(zhuǎn)染的MDBK和HeLa細(xì)胞中表達(dá)的PoIFNα的活性的256～890倍；而轉(zhuǎn)染了pcD-PoIFNβ的IBRS-2和BHK-21細(xì)胞比同樣轉(zhuǎn)染的PK-15和HeLa細(xì)胞中表達(dá)的PoIFNβ的活性高2.2～6倍，后兩種細(xì)胞又比MDBK細(xì)胞轉(zhuǎn)染后表達(dá)PoIFNβ的活性高10～14倍。對于五種轉(zhuǎn)染pcD-PoIFNγ的細(xì)胞，在PK-15、IBRS-2、BHK-21和MDBK之間沒有顯著差異。 在

10、本研究中還比較了豬α、β、γ干擾素、及其兩兩聯(lián)合預(yù)處理IBRS-2細(xì)胞后對PRV增殖的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在三種干擾素中 PoIFN-β能最有效的抵制PRV的增殖——100U/mL PoIFN-β就能使PRV空斑數(shù)目減少5.3倍；PoIFN-γ則能抑制PoIFN-γ達(dá)3.3倍；而PoIFN-α僅能抑制空斑數(shù)目1.26倍，且即使將其濃度上調(diào)至12800U/mL 其抑制倍數(shù)也僅提高至2.3倍。當(dāng)PoIFN-γ與PoIFN-α或PoIFN-β聯(lián)

11、合作用時(shí)其抑制PRV 空斑數(shù)目分別達(dá)到12.8倍和100倍。而PoIFN-α或PoIFN-β與PoIFN-γ聯(lián)合作用時(shí)也可有效抑制PRV復(fù)制達(dá)29和146倍。此外，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果也顯示了當(dāng)PoIFN-γ與PoIFN-α或PoIFN-β聯(lián)合刺激IBRS-2細(xì)胞時(shí)，PRV的立即早期基因mRNA比對照細(xì)胞減少23.8或133.0倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明PoIFN-γ能與PoIFN-α或PoIFN-β在體外產(chǎn)生協(xié)同抗PRV作用。 4、重組

12、腺病毒介導(dǎo)的豬α、β、γ干擾素的表達(dá)及rAd-PoIFNα抗PRRSV作用 分別將豬α/β干擾素(PoIFN α/β/γ)基因插入腺病毒穿梭載體pShuttle-CMV，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pSh-PoIFNα/β/γ。將此重組質(zhì)粒經(jīng)Pine Ⅰ線性化和去磷酸化后回收，與腺病毒骨架載體pAdEasy-1共同電轉(zhuǎn)化BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，在Kan平板上37℃培養(yǎng)24h，挑選較小的菌落，提取的重組質(zhì)粒經(jīng)Pac Ⅰ鑒定正確的陽性克隆命名為p

13、Ad-Sh-PoIFNα/β/γ，轉(zhuǎn)化XL10-Gold 感受態(tài)后大量制備。pAd-Sh-PoIFNα/β/γ以PacⅠ線性化后回收，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293A包裝細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染7～10天出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，說明重組了豬α/β/γ-干擾素的腺病毒基因組(缺失E1和E3基因)在其包裝細(xì)胞系中成功包裝成完整的病毒粒子。將此重組后的腺病毒連續(xù)接種傳代，每代提取病毒基因組，PCR均能擴(kuò)增出目的片段，證明該種表達(dá)豬α/β/γ-干擾素的重組腺病毒能穩(wěn)

14、定傳代。利用細(xì)胞病變抑制法，收取病變后293A細(xì)胞上清，在牛腎細(xì)胞(MDBK)上進(jìn)行干擾素抗病毒活性檢測，結(jié)果顯示豬α/β/γ干擾素的抗病毒(VSV)活性分別達(dá)83640320U/mL、5242880U/mL、1310720U/mL，說明重組腺病毒成功轉(zhuǎn)導(dǎo)豬干擾素基因，并表達(dá)出具有良好生物學(xué)活性的豬干擾素。分別以由腺病毒介導(dǎo)的100U/mL，400U/mL 和327680U/mL PoIFN-α預(yù)處理MARC-145細(xì)胞，同時(shí)設(shè)空白腺病

15、毒對照。20小時(shí)后，感染不同TCID<,50>的PRRSV，逐日觀察細(xì)胞病變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量的PoIFN-α能有效抑制細(xì)胞病變且呈一定的劑量相關(guān)及時(shí)間相關(guān)關(guān)系。此外，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果也表明即使是低劑量的PoIFN-α也能抑制PRRSV的ORF7和Nsp9基因的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)示rAd-PoIFNα能有效抑制PRRSV在體外的增殖并有望應(yīng)用于臨床對PRRSV的防制。 5、豬α、γ干擾素增強(qiáng)CSFV細(xì)胞苗(c-strain)在

16、豬體內(nèi)的IgG及l(fā)gG2的抗體水平并調(diào)節(jié)Th1免疫反應(yīng) 分別將表達(dá)的豬α、γ干擾素蛋白(1×10<'6>U、2×10<'5>U、5×10<'4>U/頭份)或豬α、γ干擾素真核質(zhì)粒(400μg/頭份)與CSFV細(xì)胞苗(c-strain)聯(lián)合免疫仔豬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二免后聯(lián)合免疫2×10<'5>U/頭份或5×10<'4>U/頭份重組蛋白豬α干擾素或三種劑量的豬γ干擾素與單獨(dú)免疫細(xì)胞苗的對照組相比能顯著提高特異性 IgG的滴度。而在首免后

17、，聯(lián)合免疫10<'6>U/頭份豬α干擾素或任一劑量的豬γ干擾素能比細(xì)胞苗對照組或聯(lián)合免疫pcD-PoIFNγ/顯著提高特異性IgG2的滴度。此外，它們還能將IgG2/IgG1的比率向Th1免疫方向調(diào)節(jié)，尤其是在聯(lián)合免疫2×10<'5>U/頭份豬γ干擾素的試驗(yàn)組。試驗(yàn)結(jié)果表明，豬γ干擾素比豬α干擾素具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力，它能有效地提高IgG、IgG1、IgG2的抗體滴度并將免疫反應(yīng)調(diào)向Th1。此外，研究也表明，干擾素蛋白比真核質(zhì)粒介導(dǎo)的