新型重組豬α-干擾素的結(jié)構(gòu)與生物功能研究.pdf

1、干擾素是一類Ⅱ型細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗病毒、抗腫瘤等多種生物功能。根據(jù)其表面受體、染色體定位、酸穩(wěn)定性等的不同，可將干擾素分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型。其中α-干擾素屬于Ⅰ型干擾素，具有強(qiáng)大的抗病毒功能。為了進(jìn)一步提高干擾素的生物活性以及擴(kuò)大干擾素在臨床上的使用，我們進(jìn)行了復(fù)合豬α-干擾素的設(shè)計(jì)、表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能的研究工作。本研究的目的在于設(shè)計(jì)重組復(fù)合豬α-干擾素，研制出安全、高效、新型的抗病毒制劑和免疫增強(qiáng)劑用于增強(qiáng)豬體的抵抗力和提

2、高現(xiàn)有疫苗的保護(hù)率。我們同時(shí)還嘗試解析豬α-干擾素的結(jié)構(gòu)，并通過(guò)分子模擬的方法模建干擾素與其受體的空間結(jié)構(gòu)，以便確定干擾素與受體的結(jié)合位點(diǎn)，為以后研究干擾素的功能并設(shè)計(jì)具有更高生物活性的干擾素打下基礎(chǔ)。
　　 1.CoPoIFN-α的設(shè)計(jì)、基因擴(kuò)增與克隆
　　 從NCBI網(wǎng)站上搜索得到17個(gè)亞型的豬α-干擾素氨基酸序列，用Bioedit序列分析軟件進(jìn)行比對(duì)后選取等位基因上出現(xiàn)頻率最高的氨基酸進(jìn)行組合，設(shè)計(jì)出本研究中的新型

3、豬α-干擾素蛋白序列，命名為CoPoIFN-α。根據(jù)酵母密碼子偏嗜性設(shè)計(jì)得到CoPoIFN-α基因序列。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)14條引物，用SOE-PCR方法擴(kuò)增后，通過(guò)EcoRI和Xba(I)內(nèi)切酶酶切后連接入畢赤酵母表達(dá)載體pPICZα，得到帶有干擾素基因的陽(yáng)性克隆，并經(jīng)酶切鑒定及核酸序列測(cè)定確定其正確性。
　　 2.CoPoIFN-α的表達(dá)與純化
　　 將重組質(zhì)粒pPICZα-CoPoIFN-α整合進(jìn)畢赤酵母X-33菌株

4、，在畢赤酵母中用甲醇在28℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)CoPoIFN-α和本實(shí)驗(yàn)室保存的重組野生型豬IFN-α: PoIFN-α。誘導(dǎo)72 h后，12000 r/min4℃離心15 min收集酵母表達(dá)上清液。首先用30％飽和度的硫酸銨沉淀去除酵母表達(dá)上清液中的部分雜蛋白，然后再用45％飽和度的硫酸銨沉淀得到含有干擾素的粗組分，再依次經(jīng)過(guò)疏水層析，陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析純化得到純的干擾素蛋白PoIFN-α和CoPoIFN-α。用鼠抗重組豬IFN

5、-α1單抗作為一抗，經(jīng)Western blot方法鑒定，結(jié)果顯示所得蛋白即為PoIFN-α和CoPoIFN-α。用圓二色譜方法對(duì)純化的PoIFN-α和CoPoIFN-α進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，分析結(jié)果表明PoIFN-α和CoPoIFN-α在溶液中都主要是以α-螺旋形式存在的。
　　 3.CoPoIFN-α的體外生物活性測(cè)定
　　 我們從4個(gè)方面檢測(cè)CoPoIFN-α的體外生物學(xué)功能，同時(shí)比較了CoPoIFN-α和 PoIFN-

6、α活性之間的差別。首先研究?jī)煞N干擾素在MDBK、PK-15和MARC-145三個(gè)細(xì)胞系上抑制水皰性口炎病毒(VSV)感染的能力。我們發(fā)現(xiàn)CoPoIFN-α抑制VSV產(chǎn)生細(xì)胞病變的能力比PoIFN-α分別高46.4、63.6和53.5倍。其次用1 ng CoPoIFN-α或者1 ng PoIFN-α預(yù)處理PK-15細(xì)胞24 h，然后感染PRV;同時(shí)用1 ng CoPoIFN-α或者1 ng PoIFN-α預(yù)處理MARC-145細(xì)胞24 h

7、，然后感染PRRSV;用TCD50測(cè)定方法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中的病毒滴度，熒光定量PCR方法測(cè)定細(xì)胞中的病毒基因組拷貝數(shù)。結(jié)果表明，PoIFN-α預(yù)處理組中PRV和PRRSV的滴度分別比CoPoIFN-α預(yù)處理組高25倍和10倍;PoIFN-α預(yù)處理組中PRV和PRRSV的基因組拷貝數(shù)分別比CoPoIFN-α預(yù)處理組分別高4.8倍和5倍。另外我們用MTT方法檢測(cè)并比較了兩種干擾素抑制PK-15細(xì)胞增殖的能力。用兩倍倍比稀釋的CoPoIFN-

8、α(0-8μg/mL)或者PoIFN-α(0-8μg/mL)處理PK-15細(xì)胞72 h后，用MTT方法檢測(cè)PK-15細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示，在0.125μg/mL-0.5μg/mL干擾素濃度范圍內(nèi)，CoPoIFN-α的抗增殖活性顯著高于PoIFN-α;在1μg/mL-8μg/mL干擾素濃度范圍內(nèi)，CoPoIFN-α的抗增殖活力亦高于PoIFN-α，并呈現(xiàn)極顯著差異。最后我們周熒光定量PCR方法比較了PoIFN-α和CoPoIFN-α在

9、PK-15細(xì)胞上對(duì)干擾素刺激基因Mx1、OAS1和PKR基因表達(dá)的影響。
　　 用1 ng CoPoIFN-α或者PoIFN-α處理PK-15細(xì)胞24h后，通過(guò)Taqman熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中干擾素誘導(dǎo)基因Mx1、OAS1和PKR的mRNA水平。結(jié)果顯示，CoPoIFN-α或者PoIFN-α預(yù)處理的PK-15細(xì)胞中Mx1和OAS1的mRNA水平都明顯提高。其中，CoPoIFN-α預(yù)處理組的OAS1的mRNA水平比PoIF

10、N-α預(yù)處理組高3.2倍，而CoPoIFN-α預(yù)處理組Mx1的mRNA水平比PoIFN-α預(yù)處理組高4.6倍。本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有檢測(cè)到PKR mRNA的表達(dá)。
　　 4.CoPoIFN-α作為豬瘟多肽疫苗佐劑的研究
　　 為了評(píng)估CoPoIFN-α作為豬瘟病毒多肽疫苗的佐劑效果，我們將pET-32a融合表達(dá)的CSFV囊膜蛋白E2上693-716位的氨基酸純化濃縮后與206佐劑乳化成豬瘟多肽疫苗pb，聯(lián)合104U、105U和10

11、6U的CoPoIFN-α共同免疫30日齡家豬，首免后兩周加強(qiáng)免疫一次。首免前一周扣首免后每周采集外周血用ELISA方法檢測(cè)血清中的CSFV抗體，首免后14d進(jìn)行病毒中和抗體測(cè)定，同時(shí)采集抗凝血并分離外周血淋巴細(xì)胞，用多肽抗原刺激分離的淋巴細(xì)胞后進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，并測(cè)定淋巴細(xì)胞分泌的IL-4和IFN-γ的水平。結(jié)果顯示，pb多肽疫苗可以誘導(dǎo)家豬產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，CoPoIFN-α可以提高pb多肽疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的體液免疫水平，并呈劑量依賴

12、性;105U的CoPoIFN-α能顯著增加pb誘導(dǎo)家豬產(chǎn)生的CSFV特異性抗體水平，但104 U的CoPoIFN-α和106 U的CoPoIFN-α只能稍微增加pb誘導(dǎo)家豬產(chǎn)生的CSFV特異性抗體水平;另外，105U的CoPoIFN-α能顯著增加pb誘導(dǎo)家豬產(chǎn)生的CSFV特異性中和抗體水平;在pb和CoPoIFN-α聯(lián)合免疫組，隨著CoPoIFN-α量的增加，淋巴細(xì)胞增殖水平和IFN-γ的分泌水平也越來(lái)越高。此結(jié)果表明，CoPoIFN-

13、α可以提高豬瘟多肽疫苗誘導(dǎo)家豬產(chǎn)生的免疫反應(yīng)水平。
　　 5.CoPoIFN-α的晶體生長(zhǎng)和計(jì)算機(jī)模擬分析干擾素及其受體的三級(jí)結(jié)構(gòu)
　　 為了準(zhǔn)確從空間結(jié)構(gòu)的角度對(duì)CoPoIFN-α的高活力進(jìn)行詮釋以便對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的改造，我們嘗試通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)的方法解析CoPoIFN-α的空間結(jié)構(gòu)。我們將純化的CoPoIFN-α分別濃縮至10 mg/mL和20 mg/mL兩個(gè)濃度，并用商品化晶體生長(zhǎng)試劑盒Crystal Screen

14、、Crystal Screen2、Index和MembFac對(duì)干擾素晶體生長(zhǎng)條件進(jìn)行篩選。初步篩選出兩個(gè)蛋白晶體生長(zhǎng)條件。通過(guò)對(duì)在這些條件下生長(zhǎng)得到的晶體進(jìn)行初步X-光射線衍射分析發(fā)現(xiàn)這些晶體的分辨率并不理想。目前正在對(duì)這些結(jié)晶條件進(jìn)一步優(yōu)化，以便能夠得到衍射能力良好的晶體。
　　 在對(duì)CoPoIFN-α晶體生長(zhǎng)條件摸索的同時(shí)，我們利用discovery studio結(jié)構(gòu)模擬軟件分別模擬出CoPoIFN-α與豬Ⅰ型干擾素受體和P

15、oIFN-α與豬Ⅰ型干擾素受體三元復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)，并對(duì)干擾素與受體的相互作用進(jìn)行了分析。在復(fù)合物模型中，我們沒(méi)有觀察到兩個(gè)干擾素中有差異的殘基與受體的直接相互作用。其中，PoIFN-α上的38位絲氨酸、151位絲氨酸和43位苯丙氨酸分別突變成了CoPoIFN-α中的苯丙氨酸、丙氨酸和亮氨酸，這些突變了的氨基酸殘基側(cè)鏈朝內(nèi)指向干擾素結(jié)構(gòu)的核心，它們改變了局部的疏水性。156位的蘇氨酸突變成了精氨酸，蛋白質(zhì)表面靜電勢(shì)分析結(jié)果顯示此突變?cè)诟?/p>