雞α干擾素(ChIFN-α)的克隆和原核表達.pdf

1、研究目的：構建雞α干擾素(ChIFN-α)的原核表達體系，優(yōu)化表達條件。
　　 研究方法：(1)從GenBank庫中查找雞α干擾素(ChIFN-α)基因并且獲得其基因序列及蛋白序列，用DNAman軟件設計引物。(2)分離并培養(yǎng)雞血淋巴細胞，從ConA刺激過8～10小時的雞血淋巴細胞中提取總RNA，經逆轉錄一聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增出雞α干擾素(ChIFN-α)基因，經低熔點瓊脂糖凝膠電泳后回收純化，將純化產物與載體pM

2、D18-T連接，轉化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，在氨芐陽性瓊脂板上篩選陽性菌落。重組載體用PCR擴增法和兩種限制性內切酶NdeⅠ和EcoRⅠ酶切進行鑒定，并進行序列測定，命名為pMD18-T-Ckα。(3)將兩種限制性內切酶NdeⅠ和EcoRⅠ酶切pMD18-T-Ckα的產物回收純化后，與載體PET30a載體連接，轉化到E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，在卡那陽性瓊脂板上篩選陽性菌落，用PCR擴增法和三種限制性內切

3、酶NdeⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ(基因序列290位的酶切位點)酶切進行鑒定，并再次進行測序，命名為PET30a-Ckα。經IPTG誘導表達。(4)經SDS-PAGE凝膠電泳圖條帶分析，并結合濕菌重篩選出最優(yōu)表達菌種，進行培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間，表達溫度，表達時間和誘導劑濃度方面表達，確定最優(yōu)表達條件；(5)超聲破菌，分離得到包涵體，并進行洗滌純化復性，Bradford法測定蛋白含量。
　　 研究結果：(1)成功培養(yǎng)出雞血淋巴細胞，并

4、成功提取到總RNA，經PCR擴增出雞α干擾素(ChIFN-α)基因。(2)成功構建出PET30a-Ckα表達體系，在E.coli BL21(DE3)中表達出雞α干擾素(ChIFN-α)蛋白，其分子量約為22KD，表達產物主要以包涵體形式存在。(3)通過優(yōu)化表達，結果在E.coli BL21(DE3)中37C培養(yǎng)濃度達到OD600值為0.7時加IPTG至終濃度為1mmol/L，再誘導3h表達，此時表達量達到最高，約占全菌蛋白的30％以上。

5、(4)進一步純化表達，用0.1mol/L Tris.cl(PH8.5)含2 mol/L尿素洗滌效果最好，表達量約占全菌蛋白的40％，采取梯度稀釋法復性得到雞α干擾素(ChIFN-α)蛋白，利用鎳柱親和層析柱200 mmol/L咪唑洗脫獲得純化蛋白。
　　 研究結論：應用基因工程技術，成功篩選出雞α干擾素(ChlFN-α)基因，并構建了原核表達載體PET30a-Ckα。通過優(yōu)化表達，得到雞α干擾素(ChIFN-α)蛋白的最優(yōu)表達條