山羊干擾素-γ與白細(xì)胞介素-2的克隆、原核表達(dá)及其抗血清的制備.pdf

1、本文對(duì)山羊干擾素-γ與白細(xì)胞介素-2的克隆、原核表達(dá)及其抗血清的制備進(jìn)行了探討。本研究根據(jù)GenBank上發(fā)表的山羊干擾素-γ和白細(xì)胞介素-2基因序列，設(shè)計(jì)了兩套引物。應(yīng)用RT-PCR方法從山羊外周血淋巴細(xì)胞中分別克隆了二者，將其克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定及DNA測(cè)序分析，表明擴(kuò)增片段分別為山羊IFN-γ和IL-2基因。測(cè)序結(jié)果顯示克隆的IFN-γ基因全長(zhǎng)501個(gè)核苷酸，編碼166個(gè)氨基酸，該基因與GenBank

2、發(fā)表的山羊干擾素-γ基因序列比較，核苷酸/氨基酸序列同源性為99.4％。經(jīng)SignalP 3.0分析表明，前23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列；IL-2基因開放閱讀框架共有468bp，編碼一條155個(gè)氨基酸的多肽，與GenBank發(fā)表的山羊白細(xì)胞介素-2基因序列(AF535145)比較核苷酸/氨基酸同源性為100.0％，與應(yīng)琦華等的山羊IL-2序列的同源性為99.1％，前20個(gè)氨基酸為該蛋白的信號(hào)肽序列。應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將IL-2基因和去除信

3、號(hào)肽的IFN-γ基因分別插入到原核表達(dá)載體pET-30a(+)的BamH Ⅰ和Hind Ⅲ位點(diǎn)上，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-CaplL-2和pET30a-CaplFN-γ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明目的基因在大腸桿菌中以包涵體形式融合表達(dá)。分別用ProBond<'TM>蛋白純化試劑盒純化，用所獲得的重組蛋白純化產(chǎn)物經(jīng)三次背部皮下多點(diǎn)注射新西蘭白兔，制備了兔抗山羊IFN-γ和兔抗山羊IL-