榮昌豬白細(xì)胞介素-2基因的克隆及原核表達(dá).pdf

1、豬白細(xì)胞介素-2(interleukin-2;IL-2)是豬免疫系統(tǒng)中重要的細(xì)胞因子，在豬抗病和免疫應(yīng)答反應(yīng)中占有重要地位。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)GenBank上發(fā)表的IL-2基因序列(X58428)設(shè)計(jì)并合成了特異性引物，無(wú)菌采取健康榮昌豬前腔靜脈血10ml(3.8％的檸檬酸鈉抗凝)，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，RPMIl640培養(yǎng)基(含7μg/m1ConA)在5％CO2條件下37℃培養(yǎng)24-70小時(shí)。提取培養(yǎng)細(xì)胞的總RNA，用RT-PCR方法

2、擴(kuò)增出約520bp的目的片段，將該片段回收并克隆到PMDl8-T載體上后進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明該基因?yàn)樨iIL-2基因。它包括豬IL-2基因的全部開放閱讀框，編碼由154個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。與GenBank上已知的豬IL-2基因相比，在405bp處有一T-C顛換，但是氨基酸并沒有發(fā)生變化。與GenBank公布的豬的IL-2序列比對(duì)同源性均為99.8％，具有較近的親緣關(guān)系。 應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將克隆的榮昌豬IL-2基因亞克隆到P

3、ET-32a(+)表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)載體。酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，用1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)重組IL-2蛋白。用RT-PCR方法檢測(cè)IL-2基因得到了轉(zhuǎn)錄，SDS-PAGE分析表明，在相對(duì)分子質(zhì)量約37kD處有明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，而對(duì)照組PET-32a(+)空質(zhì)粒菌在此處無(wú)條帶產(chǎn)生，該蛋白在IPTG誘導(dǎo)1h時(shí)沒有表達(dá)，2-4h表達(dá)量分別為7.8％、18.4％、12.3％。最后用MTT法檢測(cè)從包涵