26肽蜂毒素與基因變構(gòu)人白細胞介素2嵌合蛋白的原核表達、純化及活性測定.pdf

1、①目的:通過定點誘變的方法,構(gòu)建基因變構(gòu)IL-2(<'88>N→R)的重組克隆;將26肽蜂毒素與基因變構(gòu)的人IL-2在基因水平連接,構(gòu)建嵌合體蛋白克隆并在原核系統(tǒng)中高效表達,并進行初步純化和抗原性檢測.②方法:從一名健康男子的扁桃體細胞中分離T細胞經(jīng)PHA刺激活化后,提取細胞的RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA文庫,經(jīng)套式PCR擴增出編碼IL-2的基因,插入T-A載體后獲得編碼天然IL-2的克隆,核苷酸測序證實成功后,自行設(shè)計含有突變位點

2、的引物,利用重組PCR技術(shù),進行定點誘變構(gòu)建基因變構(gòu)IL-2(<'88>N→R)的重組克隆,DNA測序確認變構(gòu)成功.利用剪接式重疊延伸(spliced overlap extension,SOE)技術(shù)在26肽蜂毒素與基因變構(gòu)IL-2的基因之間導入四個易形成空間結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基組成的連接肽(Gly<,4>Ser)<,3>,構(gòu)建嵌合體蛋白的基因,克隆到原核表達載體pGEX4T-2中,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌DH5 α,經(jīng)IPTG誘導表達目的融合蛋

3、白,蛋白純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳與Western blotting鑒定.③結(jié)果:獲得了基因變構(gòu)IL-2的編碼基因克隆及表達嵌合蛋白的重組菌,并得到純化的融合蛋白和Thrombin酶切后的嵌合蛋白;Western blotting鑒定表明純化的重組蛋白與人IL-2的單克隆抗體有良好的抗原特異性.④結(jié)論:在原核表達系統(tǒng)中成功表達了嵌合蛋白,純化后的蛋白有望是一種新型免疫調(diào)節(jié)劑,為進一步在真核細胞中表達以及研究制備低毒、高效的新型細胞因子