豬α干擾素和白細胞介素-2在真核細胞中表達及其表達產(chǎn)物活性分析.pdf

1、目的：α干擾素（interferon-α）是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤及免疫激活功能的細胞因子，白細胞介素2在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及感染性疾病的治療中也具有重要作用，同時它還能激活B淋巴細胞，參與機體的體液免疫應(yīng)答，促進抗體分泌，增強體液免疫應(yīng)答。
　　 Mx蛋白是Ⅰ型和Ⅲ型干擾素(IFN)誘導(dǎo)細胞后產(chǎn)生的天然抗病毒蛋白，有很好抗病毒活性，且副作用小。本實驗將豬α干擾素基因和白細胞介素2基因分別轉(zhuǎn)染真核細胞，檢測這兩個基因的表達，及

2、表達產(chǎn)物的抗病毒活性。為將這兩個基因用于疫苗佐劑及轉(zhuǎn)基因抗病育種動物奠定了基礎(chǔ)。同時也克隆了豬Mx1基因啟動子及Mx1基因，并構(gòu)建了真核表達載體，為進一步研究豬Mx1基因奠定了基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴根據(jù)已發(fā)表的豬IFN-α和豬IL-2基因的核酸序列設(shè)計引物，克隆出這兩個基因，鑒定正確后將兩個基因分別連到pcDNA3.1載體上構(gòu)建真核表達載體，分別命名為pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL；⑵用構(gòu)建好的真核表達載體分別

3、轉(zhuǎn)染真核細胞通過G418篩選出轉(zhuǎn)染外源基因的細胞，并用RT-PCR進一步檢測是否整合外源基因；⑶采用實時定量PCR檢測豬IFN-α和IL-2基因在真核細胞內(nèi)mRNA表達水平、采用ELISA方法檢測豬IFN-α和IL-2基因在真核細胞內(nèi)蛋白表達水平、采用淋巴細胞增殖實驗測豬IFN-α和IL-2基因在真核細胞內(nèi)表達蛋白的生物學(xué)活性。(4)根據(jù)Genbank已公布的豬Mx1基因啟動子、Mx1基因的核苷酸序列，設(shè)計合成兩對特異引物分別擴增了豬M

4、x1基因啟動子和Mx1基因，并將這兩個基因亞克隆到含有G418篩選標(biāo)記的PGKneotpALox2真核表達載體上。
　　 結(jié)果：⑴成功克隆了豬IFN-α和豬IL-2基因，經(jīng)測序鑒定正確，并將其分別連到pcDNA3.1真核表達載體上，構(gòu)建成功pcDNA3.1-IFN、pcDNA3.1-IL轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。⑵通過G418篩選出穩(wěn)定表達豬IFN-α和豬IL-2基因的真核細胞，經(jīng)RT-PCR 鑒定為陽性。⑶實時定量PCR表明轉(zhuǎn)入豬IFN-α基

5、因的真核細胞其IFN-α mRNA表達量高于陰性未轉(zhuǎn)染組1.52倍，轉(zhuǎn)入豬IL-2基因的真核細胞其IL-2 mRNA表達量高于陰性未轉(zhuǎn)染組1.43倍；對整合外源基因真核細胞上清液ELISA檢測結(jié)果顯示，豬IFN-α的含量為121.45pg/mL，而未轉(zhuǎn)染該基因的對照組含量為89.36 pg/mL 轉(zhuǎn)染組高于對照組1.35倍。豬IL-2的含量為 97.45pg/mL，而未轉(zhuǎn)染對照組含量為75.36 pg/mL 轉(zhuǎn)染組高于對照組1.29倍；

6、經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件分析表明整合外源基因的真核細胞上清液淋巴細胞增殖作用與陰性對照組相比均差異顯著，表明這兩個基因的表達產(chǎn)物有很好的活性，可以用來抗病毒。(4)成功克隆了豬Mx1基因啟動子和Mx1基因并將這兩個基因亞克隆到PGKneotpALox2真核表達載體上。
　　 結(jié)論： 豬IFN-α和豬IL-2基因可以在真核細胞中很好表達，且表達產(chǎn)物具有很好的活性，為開發(fā)新型基因工程疫苗佐劑和轉(zhuǎn)基因抗病動物奠定了基礎(chǔ)。同時本實驗也構(gòu)建了豬