農(nóng)桿菌介導(dǎo)的橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、天然橡膠具有合成橡膠無法比擬的彈性、延展性及導(dǎo)熱性,是重要的工業(yè)原料,主要來源于巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)。巴西橡膠樹為多年生異花授粉木本作物,通過常規(guī)雜交育種手段,培育一個(gè)新品種需要20-30年。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是縮短橡膠樹育種周期、加快新品種培育十分有效的途徑,也是橡膠樹功能基因鑒定等研究的重要技術(shù)手段。盡管我國于2000年已開始橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化研究,但依然沒有建立起橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化體系,這已成為

2、制約橡膠樹基因工程遺傳改良的技術(shù)瓶頸。我國植膠區(qū)處于熱帶北緣,在大寒年份寒害給生產(chǎn)帶來重大損失。因此,通過基因工程改良現(xiàn)有的優(yōu)良無性系以提高其抗寒能力是一項(xiàng)非常重要的任務(wù)。CBF1轉(zhuǎn)錄因子能促進(jìn)多個(gè)冷誘導(dǎo)基因表達(dá),使得轉(zhuǎn)基因植株的抗寒性比單一功能基因的轉(zhuǎn)化強(qiáng)。
　　 為建立橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化體系,本研究首先篩選了適宜農(nóng)桿菌侵染的橡膠樹受體材料,然后以適宜侵染的花藥再生體系為對(duì)象,篩選高頻體胚發(fā)生的橡膠樹無性系,再通過對(duì)抗生素種類和濃

3、度、農(nóng)桿菌菌株、共培養(yǎng)溫度和共培養(yǎng)時(shí)間等影響遺傳轉(zhuǎn)化效率因素研究,最終建立以花藥愈傷組織為受體的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化體系。并在此基礎(chǔ)上,研究了擬南芥冷誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄因子CBF1轉(zhuǎn)化橡膠樹優(yōu)良無性系熱研7-33-97。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.適宜農(nóng)桿菌侵染的橡膠樹外植體篩選
　　 以花藥和內(nèi)珠被愈傷組織為受體研究了適宜農(nóng)桿菌侵染的橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化受體,結(jié)果表明內(nèi)珠被愈傷組織在農(nóng)桿菌侵染后極易褐化,很難恢復(fù)生長,因

4、此不適宜作為轉(zhuǎn)化受體。而花藥愈傷組織耐侵染,容易抑菌,很快就能恢復(fù)生長,因此,花藥愈傷組織更適宜作為根癌農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化受體。
　　 2.高頻體胚發(fā)生的橡膠樹無性系篩選
　　 對(duì)5個(gè)生長、產(chǎn)膠等性狀良好的橡膠樹無性系體胚發(fā)生能力進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示,熱研7-33-97、熱研6-62具有高的愈傷組織誘導(dǎo)率和體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力且綜合性狀優(yōu)良。
　　 3.抑菌和篩選抗生素種類及濃度篩選
　　 500mg.L-1特泯

5、丁抑制胚性愈傷組織生長但促進(jìn)體胚發(fā)生,而羧芐青霉素、頭孢霉素和特泯丁三種抑制農(nóng)桿菌抗生素均為促進(jìn)愈傷組織生長但抑制體胚發(fā)生。潮霉素、卡那霉素和巴龍霉素三種篩選抗生素均抑制愈傷組織生長和體胚發(fā)生,三者抑制能力順序?yàn)槌泵顾兀究敲顾兀景妄埫顾?。故特泯丁可以作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)巴西橡膠樹花藥愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化的抑菌抗生素,500mg.L-1使用濃度效果較好,卡那霉素作為篩選抗生素,50mg.L-1使用濃度效果較好。
　　 4.影響遺傳轉(zhuǎn)化效率

6、因素的研究
　　 農(nóng)桿菌菌株、共培養(yǎng)溫度和共培養(yǎng)時(shí)間等對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率具有顯著影響,EHA105菌株侵染力最強(qiáng),共培養(yǎng)溫度為22℃和共培養(yǎng)時(shí)間為6d時(shí),GUS瞬時(shí)表達(dá)率最高。共培養(yǎng)基中添加As無助于橡膠樹花藥愈傷組織轉(zhuǎn)化效率的提高。
　　 5.轉(zhuǎn)基因植株鑒定及轉(zhuǎn)化體系的建立
　　 2.2萬個(gè)花藥愈傷組織在EHA105侵染后,通過抗性篩選、GUS染色、PCR、測序、Southern檢測及Northern檢測,鑒定出1

7、1株轉(zhuǎn)基因植株,并檢測到目的基因表達(dá),隨后通過嫁接和次生體胚發(fā)生,獲得來自8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系681株轉(zhuǎn)基因植株,移栽成活253株。
　　 6.轉(zhuǎn)基因植株移栽
　　 以未經(jīng)增殖直接大田移栽、嫁接到室外砧木和通過次生體胚發(fā)生增殖后大田移栽三種方式進(jìn)行移栽,結(jié)果3株未經(jīng)增殖直接移栽到大田,均未成活;3株通過籽苗芽接進(jìn)行1輪室外嫁接繁殖,獲得5株轉(zhuǎn)基因單株,全部移栽成活;其余5個(gè)在胚狀體階段進(jìn)行3次次生體胚發(fā)生增殖后誘導(dǎo)植株再生,最