白術(shù)再生體系建立與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、白術(shù)(Atractylodes macrocephala Koidz)為多年生菊科藥用植物。野生白術(shù)資源在逐年減少，大部分的藥用來(lái)源均為栽培品種。近年來(lái)白術(shù)栽培過(guò)程中受到的各種病蟲(chóng)害的威脅，嚴(yán)重影響到白術(shù)的品質(zhì)和產(chǎn)量。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是遺傳改良的有效手段，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入抗病基因提高白術(shù)的抗病性值得探索。本實(shí)驗(yàn)采用白術(shù)栽培品種，建立了高效的白術(shù)離體再生體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的白術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系。將分別來(lái)源于苜蓿斜紋夜蛾昆蟲(chóng)桿狀病毒和甜菜夜蛾中的凋亡

2、抑制基因p35和iap導(dǎo)入白術(shù)中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴真葉、莖尖、下胚軸和上胚軸外植體誘導(dǎo)多芽的最佳培養(yǎng)條件為MS+TDZ0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.2 mg/L、0.2 mg/L，分化率分別可達(dá)47.5±3.96％、75.1±4.41％、78.7±7.11％、88.4±5.34％;其中上胚軸的繁殖系數(shù)最高可達(dá)15.9±0.64，是最佳的外植體。利用1/2MS+NAA0.1 mg/L可以促進(jìn)多

3、芽生根，生根率可達(dá)90.3±0.43％。移栽成活率可達(dá)93.3％。⑵利用pBar-Gus載體建立了白術(shù)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，菌液濃度為0.4的條件下侵染20 min，共培時(shí)添加200μmol/LAS并共培2d條件下，PCR檢測(cè)表明轉(zhuǎn)化率達(dá)15.8％;轉(zhuǎn)化篩選后的抗性組織、多芽、根、T1代小花等GUS染色陽(yáng)性。采用試紙條快速檢測(cè)T1代植株，bar基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)，陽(yáng)性率為76％。150 mg/LBasta溶液噴灑結(jié)果表明:轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Basta抗性

4、顯著提高。⑶將目的基因p35和iap成功導(dǎo)入了白術(shù)，T0代植株P(guān)CR檢測(cè)轉(zhuǎn)化率為12.70％。;對(duì)PCR及試紙條檢測(cè)為陽(yáng)性的植株進(jìn)行灰霉病菌活體接種，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在25個(gè)白術(shù)植株中9株對(duì)灰霉病抗性增強(qiáng)。創(chuàng)造了可利用的育種材料。⑷利用熒光定量PCR方法檢測(cè)了4株T0代轉(zhuǎn)pBar-Gus的植株，發(fā)現(xiàn)bar基因拷貝數(shù)為2-3個(gè)。對(duì)繁殖所得T1代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)四個(gè)株系的分離比分別為3∶1、3.67∶1、3.75∶1、4.5∶1，表明一個(gè)