香石竹再生體系的建立及根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究.pdf

1、香石竹(DianthuscaryophyllusL)是世界四大切花之一，在花卉市場(chǎng)中占有重要地位。香石竹的育種目標(biāo)除觀賞性狀之外，還有園藝性狀，我國(guó)目前以鏈格孢屬(altemaria)引起的葉斑病比較普遍且嚴(yán)重，抗病育種已成為香石竹育種的重要目標(biāo)。另外，耐熱性、豐產(chǎn)性也是香石竹育種研究中的重要目標(biāo)。因此，運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，導(dǎo)入目的基因，解決育種中的問(wèn)題，使香石竹獲得目標(biāo)性狀便具有十分重要的意義。 本實(shí)驗(yàn)以建立的香石竹高頻再生體系為

2、基礎(chǔ)，利用GUS染色組織分析法，研究了影響根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)LBA4404菌株介導(dǎo)的香石竹遺傳轉(zhuǎn)化的若干因素，建立了香石竹快速有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。香石竹的分化培養(yǎng)基、附加乙酰丁香酮與否、預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間、菌液濃度及浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間和卡那霉素濃度等對(duì)轉(zhuǎn)化頻率的影響。抗性植株經(jīng)GUS檢測(cè)表明，外源基因基本已整合進(jìn)香石竹基因組中。 香石竹再生體系的建立。確定以香石竹無(wú)菌苗葉片為外植體，從不同細(xì)胞分裂素及其他激素配

3、合使用等方面進(jìn)行選擇篩選，建立香石竹葉片離體再生體系。結(jié)果表明，不同的細(xì)胞分裂素影響葉片不定芽分化頻率，其中較低濃度的NAA(0.1mg/L)和TDZ(1.0mg/L)配合使用能有效誘導(dǎo)香石竹葉片不定芽分化。因此，香石竹葉片不定芽分化的適宜培養(yǎng)基為：MS+1.0mg/LTDZ+0.1mg/LNAA；壯苗培養(yǎng)基為：MS+0.5mg/LBA+0.05mg/LNAA。 香石竹遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。用根癌農(nóng)桿菌(A.tumefaciens

4、)LBA4404菌株，介導(dǎo)香石竹的遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)行比較試驗(yàn)得出：預(yù)培養(yǎng)基為MS+1.0mg/LTDZ+0.1mg/LNAA，預(yù)培養(yǎng)2d；共培養(yǎng)基為MS+0.1mg/LNAA+1.0mg/LTDZ+100μmol/LAS，暗培養(yǎng)3d；選擇分化培養(yǎng)基MS+0.1mg/LNAA+1.0mg/LTDZ+60mg/LKm+400mg/LCef中篩選培養(yǎng)；再生的抗性苗的生根篩選培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/LNAA+25mg/LKm。 轉(zhuǎn)基