根癌農(nóng)桿菌介導的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、盾葉薯蕷(DioscoreazingiberensisC.H.Wright)，是我國特有的甾體激素類藥源植物，也是世界上薯蕷皂甙元含量最高的資源植物。近些年，由于人類的過度采挖，野生盾葉薯蕷資源瀕臨枯竭，而人工栽培種存在皂甙元含量降低，種質(zhì)退化等問題。細胞和基因工程技術可望為盾葉薯蕷的品種改良提供一個新的途徑。本實驗篩選了盾葉薯蕷易組織培養(yǎng)的基因型，并以其三種外植體-幼胚誘導的胚性愈傷，花序愈傷和花序作為轉(zhuǎn)化受體，研究了根癌農(nóng)桿菌介導的

2、盾葉薯蕷轉(zhuǎn)化的各種影響因素，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，初步建立了根癌農(nóng)桿菌介導的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)化體系，為通過轉(zhuǎn)基因技術對其進行品種改良的研究奠定了技術基礎。主要研究結果如下： 1.轉(zhuǎn)化受體的準備。 (1)基因型篩選。利用盾葉薯蕷四種基因型的幼胚進行了愈傷誘導實驗，結果表明：不同基因型的組織培養(yǎng)能力不同，田間編號為4-73的材料最易進行組織培養(yǎng)，幼胚愈傷誘導率最高，達95.3％；其次是4-61，誘導率為91.2％；然后是5-88，誘導

3、率為76.3％；4-72幾乎沒有誘導出愈傷。選擇最容易組織培養(yǎng)的4-73作為以后研究的材料。 (2)幼胚來源的愈傷繼代和狀態(tài)改良。4-73的幼胚誘導出來的初代愈傷，不成顆粒，生長緩慢，而且水浸狀嚴重，再生困難，難以直接進行轉(zhuǎn)化研究。通過調(diào)節(jié)激素種類與濃度、基本培養(yǎng)基成分，有機添加物，改變繼代方式等，經(jīng)過長時間的改良后，產(chǎn)生了白黃色，致密，表面呈顆粒的胚性愈傷。 (3)花序愈傷誘導。取4-73幼嫩的花序，在MS附加0.5m

4、g/L2，4-D，1.0mg/L6-BA或0.2mg/L2，4-D，1.0mg/L6-BA兩種培養(yǎng)基上，均能誘導出高質(zhì)量的愈傷。 2.影響轉(zhuǎn)化的主要因素研究. (1)外植體類型對轉(zhuǎn)化的影響。利用4-73幼胚來源的胚性愈傷、花序誘導的愈傷以及花序三種外植體，分別與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，比較GFP的瞬間轉(zhuǎn)化率。幼胚來源的胚性愈傷轉(zhuǎn)化率最高，達到49.3％；花序愈傷轉(zhuǎn)化率次之，達到40.5％；花序的瞬間轉(zhuǎn)化率最低，只有5.5％，不適

5、合直接作為轉(zhuǎn)化的受體。 (2)預培養(yǎng)對轉(zhuǎn)化的影響。分別用幼胚來源的胚性愈傷和花序愈傷兩種外植體作為轉(zhuǎn)化受體，比較預培養(yǎng)與否時，GFP的瞬間轉(zhuǎn)化率。結果表明：兩種外植體經(jīng)過預培養(yǎng)均比不經(jīng)過預培養(yǎng)時轉(zhuǎn)化率要高，預培養(yǎng)對轉(zhuǎn)化有利。 (3)預培養(yǎng)基和共培養(yǎng)基成分對轉(zhuǎn)化的影響。通過MS，1/4MS和去掉CaCl2的MS三種基本培養(yǎng)基作為預培養(yǎng)和共培養(yǎng)基。結果發(fā)現(xiàn)，去掉CaCl2的MS最適合用作預培養(yǎng)和共培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。

6、(4)AS對轉(zhuǎn)化的影響。通過是否添加200μmol/LAS時的GFP瞬間轉(zhuǎn)化率比較，發(fā)現(xiàn)預培養(yǎng)和共培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中添加200μmol/LAS有利于提高轉(zhuǎn)化率。 (5)農(nóng)桿菌浸染濃度對轉(zhuǎn)化的影響。分別用OD600為0.3，0.5，0.8的農(nóng)桿菌浸染液，感染胚性愈傷后，比較GFP瞬間轉(zhuǎn)化率，結果顯示，盾葉薯蕷轉(zhuǎn)化的最佳菌液濃度為OD600=0.5。 (6)共培養(yǎng)時間對轉(zhuǎn)化的影響。用幼胚胚性愈傷作為受體，分別統(tǒng)計共培養(yǎng)1d、

7、2d、3d、4d后，GFP的瞬間轉(zhuǎn)化率。結果表明，共培養(yǎng)3d時瞬間轉(zhuǎn)化率最高。 (7)轉(zhuǎn)化參數(shù)的驗證。以幼胚胚性愈傷和花序愈傷為受體，利用含有GUS報告基因載體的農(nóng)桿菌EHA105介導，按照以上得出的轉(zhuǎn)化參素進行轉(zhuǎn)化，驗證轉(zhuǎn)化參數(shù)是否合適。結果顯示：兩種受體共培養(yǎng)后，經(jīng)過GUS染液染色過夜，在大部分外植體上都觀察到藍斑，從而驗證了前面得出的轉(zhuǎn)化參數(shù)是正確的。 3.轉(zhuǎn)化細胞的篩選、擴繁和再生，以及轉(zhuǎn)基因植株PCR的鑒定。

8、 (1)潮霉素篩選濃度的確定。將胚性愈傷轉(zhuǎn)到含有潮霉素9個濃度梯度的培養(yǎng)基上，生長1個月后，觀察愈傷在各個濃度上的生長狀態(tài)，以確定潮霉素的篩選濃度。結果顯示：在盾葉薯蕷轉(zhuǎn)化實驗中，合適的潮霉素篩選濃度為70mg/L。 (2)轉(zhuǎn)化細胞的篩選、擴繁和再生。共培養(yǎng)后，將各外植體轉(zhuǎn)到響應的篩選培養(yǎng)基上，經(jīng)過1-2個月的篩選，只有幼胚來源的胚性愈傷作為受體，進行轉(zhuǎn)化后，產(chǎn)生了抗性愈傷，抗性愈傷在不含抗生素的培養(yǎng)基上擴繁兩次，在再生培