根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小鹽芥(Thellungiella halophila)遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、土壤鹽漬化是一個全球性的資源和生態(tài)問題。據(jù)統(tǒng)計，全球目前有各種鹽漬化土地約9.5億h㎡并有擴(kuò)大的趨勢，我國土壤鹽漬化形勢也十分嚴(yán)峻。土壤鹽漬化對社會經(jīng)濟(jì)尤其是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有較大的影響，解決土壤鹽漬化問題十分重要和緊迫。通過生物技術(shù)手段解決土壤鹽漬化問題較傳統(tǒng)方法具有成本低、保護(hù)環(huán)境等優(yōu)勢，因此，具有廣闊的前景。
　　 小鹽芥為十字花科（Cruciferae）鹽芥屬（Thellungiella）一年生草本植物。小鹽芥與模式植物擬南芥（

2、Arabidopsis）有很多相似的特征：植株矮小、生長期短、種子豐富、自花受粉等。小鹽芥與擬南芥同屬十字花科，而且近緣，在cDNA水平上，兩者有90％以上的同源序列，因此，便于利用擬南芥的基因組序列。此外，作為鹽生植物，較低鹽濃度能使小鹽芥鮮重、干重和光合速率增長，在300mMNaCl條件下，小鹽芥能完成生活史，小鹽芥還能在高鹽環(huán)境下（500mMNaCl）生存，此外，小鹽芥還耐-15℃低溫和干旱。因此，小鹽芥在植物耐鹽機理方面具有潛在

3、的理論和實踐價值，近年來開始作為耐鹽模式植物。
　　 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens） Ti（tumor-inducing plasmid）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是目前研究得最多、機理最清楚、技術(shù)方法最成熟的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)之一。迄今所獲得的近200種轉(zhuǎn)基因植物中，80％以上是通過根癌農(nóng)桿菌系統(tǒng)轉(zhuǎn)化獲得的。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法有多種，其中葉盤法是雙子葉植物較為常用也較為簡單有效的方法。
　　 本

4、實驗的目的在于建立小鹽芥的遺傳轉(zhuǎn)化體系。本實驗研究了次氯酸鈉（NaClO）不同消毒時間對外植體污染率的影響和不同的植物激素及不同濃度對小鹽芥愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽分化的影響；本實驗還研究了乙酰丁香酮添加方式、共培養(yǎng)時間和選擇壓的大小對根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小鹽芥的影響，以及外植體上所附根癌農(nóng)桿菌的處理方法，從而為建立高效的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。
　　 本實驗以葉柄為外植體，經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化、生根和移栽建立了小鹽芥的再生體

5、系；在此基礎(chǔ)上，通過預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)和GUS組織化學(xué)染色檢測，初步建立了小鹽芥的遺傳轉(zhuǎn)化體系。本實驗主要研究結(jié)果如下：
　　 （1）小鹽芥愈傷誘導(dǎo)和芽分化培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，芽分化需30d，芽分化率為67％。生根培養(yǎng)基為1/2MS，15d生根。6-BA與2，4-D組合可誘導(dǎo)愈傷但不能分化出芽。
　　 （2）預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA，預(yù)

6、培養(yǎng)需3d。根癌農(nóng)桿菌菌液OD600=0.5侵染5min。共培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+19.6mg/LAS，暗培養(yǎng)3d。共培養(yǎng)時間低于3d不利于農(nóng)桿菌充分侵染，多于3d則會造成農(nóng)桿菌大量繁殖損傷外植體。選擇培養(yǎng)基為MS+2.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+300mg/LCef+10mg/LHyg。生根培養(yǎng)基為1/2MS+300mg/LCef+10mg/LHyg。
　　 （3）選擇培