根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的酸櫻桃離體葉片高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、核果類果樹主要包括桃、李、杏、扁桃、櫻桃等，在植物分類上屬于薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus L.)植物，在果樹生產(chǎn)中占有相當(dāng)重要的地位。長(zhǎng)期以來(lái)，核果類果樹一直被國(guó)內(nèi)外同行公認(rèn)為是最難進(jìn)行離體(無(wú)性材料)再生的一類樹種，大家在這方面曾經(jīng)嘗試做過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，但成效甚微。核果類果樹由于其自身的離體再生困難等問(wèn)題，基因工程技術(shù)的研究也明顯地相對(duì)落后于其它果樹的發(fā)展。因此，建立和完善有效的遺傳轉(zhuǎn)化再生系統(tǒng)就成為開展核果類果樹在這

2、一領(lǐng)域研究的關(guān)鍵。長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)外的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室一直致力于這方面的研究，并取得了一定的研究成果。種種跡象表明，核果類果樹(無(wú)性材料)遺傳轉(zhuǎn)化高效再生技術(shù)有望在近期取得突破。 櫻桃是一年當(dāng)中最早上市的水果，俗有春果第一枝的美譽(yù)。其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，用途廣。除鮮食外還可以做點(diǎn)心、釀酒、入藥等功能。酸櫻桃還具有調(diào)中益氣、養(yǎng)精止瀉等滋補(bǔ)功能。其葉、核、果皆可入藥，通身無(wú)棄物。由于多元酚類化合物含量較高，因此有明顯的抗癌、抗動(dòng)脈硬化和其他心血管疾

3、病的功效。然而在栽植當(dāng)中容易感染根癌病，大大限制了該優(yōu)良樹種的推廣，因而提高它的抗逆性是今后發(fā)展的目標(biāo)。傳統(tǒng)的育種方法周期長(zhǎng)，而基因工程為加快其育種進(jìn)程提供了新的手段。但是缺乏高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，為建立櫻桃優(yōu)良的遺傳轉(zhuǎn)化體系，本論文以酸櫻桃為材料，用離體葉片作為外植體，建立了離體葉片高頻再生體系;并通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)從優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化的各項(xiàng)參數(shù)，建立了離體葉片高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，其結(jié)果如下: 1.確定酸櫻桃離體葉片的再生體系從再生培養(yǎng)基

4、、激素配比、葉片生理狀態(tài)、培養(yǎng)基中瓊脂用量、不同培養(yǎng)容器等幾個(gè)方面對(duì)影響離體葉片高效再生的關(guān)鍵因素進(jìn)行了研究。確定了CAB-6p的再生培養(yǎng)基為WPM，最佳激素配比是BA 2mg/L+IAA 2mg/L，葉片的最佳生理狀態(tài)為試管苗頂部新發(fā)出的極為幼嫩并且是合攏狀態(tài)的幼葉，瓊脂的使用濃度為4.5g/L，離體葉片誘導(dǎo)再生的培養(yǎng)容器用廣口瓶再生效果最好。 2.酸櫻桃遺傳轉(zhuǎn)化中對(duì)抗生素抗性敏感性試驗(yàn)的研究驗(yàn)研究表明，卡那霉素的篩選最佳濃度

5、應(yīng)為40mg/1。認(rèn)為頭孢唑啉鈉是CAB-6p的最佳抑菌抗生素，且適宜的濃度范圍為500mg/1-600mg/1。 3.酸櫻桃遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立用無(wú)菌的CAB-6p試管苗的離體葉片作為受體，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系的多項(xiàng)參數(shù):以0D500為0.5-1.0的農(nóng)桿菌菌液侵染10min后共培養(yǎng)3天，能獲得的GUS+率高達(dá)80％以上。 4.本實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步研究了立即篩選、延遲篩選、梯度篩選三種選擇方式對(duì)抗性芽的百分率及轉(zhuǎn)化率的影響