多年生黑麥草離體再生體系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、多年生黑麥草（Lolium perenne L．）（perenial ryegrass）是一種優(yōu)良的牧草和草坪草，其栽培品種繁多，廣泛種植于世界各地。但由于自交不親和，而導(dǎo)致利用傳統(tǒng)方法對其進(jìn)行遺傳改良困難而復(fù)雜。生物技術(shù)尤其是轉(zhuǎn)基因技術(shù)能夠有效解決這一難題，并快速改善不良的靶基因性狀。過去，針對于單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，主要采用基因槍法；隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日臻完善，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法越來越多的被應(yīng)用于單子葉植物之中。 本實(shí)驗(yàn)

2、在研究黑麥草離體培養(yǎng)基礎(chǔ)之上，著重對農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）介導(dǎo)的多年生黑麥草高效遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)獲得如下結(jié)果： （1）以6種多年生黑麥草夜影、暢通、綠寶石、頂峰、Nu Speed、A8393的成熟胚和生長點(diǎn)為外植體，在含有6種不同2，4-D濃度的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，發(fā)現(xiàn)5．0 mg/L2，4-D誘導(dǎo)兩種外植體形成愈傷組織及胚性愈傷組織的效果最好，其中成熟胚的愈傷組織及胚性愈

3、傷組織平均頻率最高為50%和35%；生長點(diǎn)愈傷組織及胚性愈傷組織平均頻率最高為60%和45%。 （2）不同黑麥草愈傷組織的分化頻率不同，以夜影的分化頻率最高，可達(dá)98%。另外，加有一定6-BA濃度的MS培養(yǎng)基有助于胚性愈傷組織的分化，當(dāng)6-BA濃度為1．0 mg/L時愈傷組織的分化率最高，為87．5%。 （3）以繼代14d左右的胚性愈傷組織為材料進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)農(nóng)桿菌工程菌液濃度OD650為0．8時，GU

4、S陽性發(fā)生率最高（57．3%）；添加200mmol/L乙酰丁香酮，侵染20min、共培養(yǎng)3d的抗性愈傷組織頻率最高，為56%。 （4）使用不同濃度的兩種脫菌劑-羧芐青霉素和Timentin對共培養(yǎng)愈傷組織進(jìn)行脫菌處理，發(fā)現(xiàn)timentin在200mg/L濃度下抑菌效果達(dá)到100%，而羧芐青霉素至少應(yīng)在250mg/L的濃度下才能有效脫菌。 （5）不同濃度的潮霉素對轉(zhuǎn)化的愈傷組織交替篩選有助于獲得轉(zhuǎn)基因植株；以80 mg/L