農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花生遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化研究.pdf

1、花生的品質(zhì)和產(chǎn)量極易受到生物和非生物逆境的影響。栽培種花生缺少逆境抗源，使花生逆境抗性的常規(guī)育種受到限制。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程方法打破花生物種間的遺傳障礙，將優(yōu)良目的基因定向轉(zhuǎn)移到花生中以提高其抗性、改良其品質(zhì)成為可能。因此，開展花生轉(zhuǎn)基因育種具有重要現(xiàn)實(shí)意義。為建立高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，本研究以花生品種麻油1-1、弗落蔓生和濮花23號(hào)的胚小葉和子葉節(jié)為外植體受體，通過優(yōu)化花生再生體系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，進(jìn)行外

2、源Bar基因的轉(zhuǎn)化，為花生的遺傳轉(zhuǎn)化提供良好的技術(shù)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.研究了不同濃度的卡那霉素(Kan)對(duì)花生胚小葉生長(zhǎng)發(fā)育、叢生芽分化和叢生芽生根階段的影響。結(jié)果表明，胚小葉叢生芽分化的Kan篩選濃度依次為:弗落蔓生150 mg/L、麻油1-1100 mg/L和濮花23號(hào)50 mg/L;叢生芽生根的Kan篩選濃度為:弗落蔓生20mg/L、麻油1-120 mg/L和濮花23號(hào)10 mg/L。三個(gè)品種中，弗落蔓生對(duì)Ka

3、n的敏感性較低，而濮花23號(hào)表現(xiàn)對(duì)Kan很強(qiáng)的敏感性。說明不同基因型花生對(duì)Kan的敏感性不同。
　　2.研究了高效誘導(dǎo)伸長(zhǎng)苗生根的激素組合。結(jié)果表明生根培養(yǎng)基1/2 MS+1mg/L NAA+0.2 mg/L IAA誘導(dǎo)生根率最高，達(dá)100％。
　　3.初步探索了以花生子葉節(jié)為外植體的再生轉(zhuǎn)化體系?；ㄉ尤~節(jié)再生對(duì)Kan較敏感，芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中Kan的最適濃度為100 mg/L。品種麻油1-1和弗落蔓生的子葉節(jié)外植體在培養(yǎng)基M

4、SB5+6 mg/L6-BA+2 mg/L2，4-D中誘導(dǎo)芽效果最好。品種濮花23號(hào)子葉節(jié)的最佳誘導(dǎo)芽培養(yǎng)基是MSB5+10 mg/L6-BA+2 mg/L2，4-D。表明基因型對(duì)再生率有很大的影響，不同花生品種不定芽的形成有明顯的差異。
　　4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，研究了花生胚小葉遺傳轉(zhuǎn)化過程中菌液濃度、侵染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抗叢生芽效率的影響。結(jié)果表明3個(gè)因素均對(duì)抗叢生芽誘導(dǎo)率有顯著影響，其誘導(dǎo)效應(yīng)依次是共培養(yǎng)時(shí)間＞侵染時(shí)間

5、＞菌液OD值。根據(jù)研究得到農(nóng)桿菌介導(dǎo)花生胚小葉轉(zhuǎn)化的最佳條件是:菌液OD值為0.5，侵染時(shí)間25 min，共培養(yǎng)時(shí)間3d。
　　5.通過對(duì)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化研究，提出了農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的花生基因轉(zhuǎn)化的技術(shù)流程:選取大小一致飽滿的花生種子，消毒之后在萌發(fā)培養(yǎng)基上MSB5+6 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，之后將預(yù)培養(yǎng)8d的胚小葉進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，用農(nóng)桿菌菌液OD600=0.5的重懸菌浸染25 min，然后放在鋪

6、有濾紙的共培養(yǎng)基MSB5+5 mg/L AS中進(jìn)行暗培養(yǎng)3d，轉(zhuǎn)接到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上MSB5+6 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+300 mg/L Cef+50 mg/L Kan上，每20 d繼代1次，繼代1～2次后，轉(zhuǎn)接到伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中MSB5+4 mg/L6-BA+0.2 mg/LNAA+250 mg/L Cef+100 mg/L Kan或MSB5+0.2 mg/L NAA+4 mg/L6-BA+2 mg/LGA3+25

7、0 mg/L+100 mg/L Kan中，經(jīng)過1～2次繼代，待伸長(zhǎng)到3～4 cm轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2MS+1 mg/L NAA+0.2 mg/L IAA+20 mg/L Kan上生根培養(yǎng)，進(jìn)行15d的生根培養(yǎng)煉苗移栽。
　　6.Bar基因篩選劑草丁磷(PPT，Phosphinothricin)葉面涂抹的適宜濃度均為75 mg/L。利用優(yōu)化的條件，將Bar基因?qū)牖ㄉ贩N麻油1-1中，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)和表型鑒定的后代轉(zhuǎn)基因植株13株