農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化及TaATG8的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、小麥?zhǔn)俏覈饕募Z食作物之一，是人類重要的植物蛋白質(zhì)攝取來源，在食品工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占重要地位。小麥品種的遺傳改良一直受到廣泛的重視。由于傳統(tǒng)的育種方式難以滿足現(xiàn)代社會中人們對小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的需求，加上病蟲害等一些不利因素的影響，常造成小麥產(chǎn)量的大幅度下降和品質(zhì)降低。應(yīng)用生物技術(shù)手段改良小麥品種以提高其抗病蟲能力、品質(zhì)、產(chǎn)量越來越受到人們的重視。因此，建立高效穩(wěn)定的組織培養(yǎng)體系提高小麥遺傳轉(zhuǎn)化效率將為分子育種奠定基礎(chǔ)。
　　 目

2、前，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚轉(zhuǎn)化體系中，存在愈傷組織分化再生率低，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率較低的問題，因此建立優(yōu)良的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥成熟胚再生體系是非常必要的。本研究以小麥品種5389為受體材料，通過摸索不同培養(yǎng)基、2，4-D對胚性愈傷組織形成的影響，抗氧化劑濃度、外植體苗齡、激素配比、共培養(yǎng)時間及抑菌劑對愈傷組織分化的影響，優(yōu)化了小麥成熟胚轉(zhuǎn)化體系。
　　 自噬(Autophagy)是細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏或應(yīng)激條件下，通過降解細(xì)胞內(nèi)衰老的長壽命蛋

3、白質(zhì)、受損傷的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞器，為細(xì)胞的重建、再生和修復(fù)提供必需原料，實現(xiàn)細(xì)胞的再循環(huán)和再利用，是生物體內(nèi)一種重要的防御和保護(hù)機制。本課題組最近的工作表明，在小麥與葉銹菌組成的親和和不親和互作體系中，自噬相關(guān)基因TaATG8在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)都存在明顯差異，暗示著TaATG8可能與小麥抗葉銹菌侵染有關(guān)。本研究構(gòu)建了小麥TaATG8基因的超表達(dá)和RNAi植物雙元表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105中，并利用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小

4、麥成熟胚轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，以期為進(jìn)一步研究TaATG8在小麥抗葉銹菌侵染過程中的作用及作用機制奠定基礎(chǔ)。本研究主要獲得以下結(jié)果:
　　 1.小麥品種5389誘導(dǎo)胚性愈傷組織的2，4-D適宜濃度為2 mg·L-1，所選培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
　　 2.適宜小麥遺傳轉(zhuǎn)化的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)時間為20 d，抗氧化劑維生素C濃度為2 mg·L-1，共培養(yǎng)時間為3d，最佳激素配比為:玉米素ZT1.0 mg·L-1、BA0.5 mg

5、·L-1和IAA0.5 mg·L-1，在抑菌劑特美汀(Timentin)為100 mg·L-1、頭孢霉素(Cef)為200mg·L-1時能夠有效抑制農(nóng)桿菌生長且能明顯提高愈傷抗性和叢生芽再生率。
　　 3.分別經(jīng)DNA-PCR和RT-PCR驗證，確定獲得轉(zhuǎn)化GUS基因陽性植株。
　　 4.利用去除終止子的TaATG8片段與GFP融合后構(gòu)建植物表達(dá)載體，通過注射煙草進(jìn)行瞬時表達(dá)，通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)TaATG8在胞