農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化及再生體系研究.pdf

1、小麥?zhǔn)侨祟愘囈陨娴闹饕Z食作物之一，其產(chǎn)量直接關(guān)系到人類的生存與發(fā)展并在整個(gè)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。鹽害脅迫嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)，采用常規(guī)育種方法提高小麥耐鹽性，獲得抗鹽性強(qiáng)的新品種十分困難。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用植物基因工程技術(shù)進(jìn)行小麥遺傳改良是遺傳育種的新方向，在未來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中前景廣闊。
　　 相對(duì)于二倍體的水稻和玉米面言，異源六倍體小麥(2n=6x=42)基因組巨大，組織培養(yǎng)困難、突破較晚，轉(zhuǎn)基因研究起步晚，農(nóng)桿菌

2、轉(zhuǎn)化條件更為復(fù)雜和嚴(yán)格，小麥轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)程明顯落后于其他作物。
　　 轉(zhuǎn)錄因子是一類能與真核基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件相結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因時(shí)空表達(dá)的蛋白質(zhì)因子。研究表明，植物鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子在抗旱、抗凍及抗鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。本研究所用鋅指蛋白基因（TaCHP）來源于本實(shí)驗(yàn)室建立的小麥/長(zhǎng)穗偃麥草體細(xì)胞雜交漸滲新品種山融3號(hào)(SR3)。該品系是通過不對(duì)稱體細(xì)胞雜交，將長(zhǎng)穗偃麥草(Agropyron elongatum2n

3、=70)的染色體小片段或/和DNA漸滲入普通小麥濟(jì)南177(JN177)基因組得到的。在擬南芥的前期研究中發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)在含100和150mM NaCl培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)TaCHP基因擬南芥的葉片和根系都好于野生型對(duì)照。
　　 本研究將抗鹽相關(guān)TaCHP基因?qū)胄←溣着邅碓吹挠鷤M織，獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了分子生物學(xué)與表型鑒定分析;對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥愈傷組織轉(zhuǎn)化體系的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，完善了轉(zhuǎn)化流程，對(duì)實(shí)驗(yàn)室組培條件下

4、，轉(zhuǎn)基因再生植株的移栽進(jìn)行了初步探索。
　　 主要研究成果如下:
　　 1、將構(gòu)建于pGA3626載體上的鋅指蛋白TaCHP基因?qū)胗着邅碓吹男←満松?號(hào)、楊麥15、矮抗58胚性愈傷組織，獲得21個(gè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，經(jīng)PCR擴(kuò)增、Southern Blot雜交驗(yàn)證與抗鹽及抗除草劑表型鑒定證明，目的基因穩(wěn)定存于T1轉(zhuǎn)基因植株基因組中，現(xiàn)己收獲T1代種子。
　　 2、采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒pG A3626-TaCH

5、P（含Bar篩選基因和GUS報(bào)告基因）上攜帶的小麥抗鹽相關(guān)TaCHP基因?qū)牒松?號(hào)小麥愈傷組織受體，對(duì)影響轉(zhuǎn)化率的主要因素進(jìn)行了優(yōu)化:
　　 ①轉(zhuǎn)化前在超凈臺(tái)吹干處理愈傷組織30min，可使GUS陽(yáng)性檢測(cè)率提高到25.39％;
　　 ②25℃的共培養(yǎng)溫度能同時(shí)保持愈傷組織與農(nóng)桿菌活性;
　　 ③共培養(yǎng)后用MS液體培養(yǎng)基洗滌轉(zhuǎn)化的愈傷組織1-2次，然后無菌濾紙吸干并轉(zhuǎn)移到含有Timentin（160mg/l）的恢