高羊茅離體培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、病害是遏制當(dāng)今草坪業(yè)健康發(fā)展的主要因素，高羊茅(Festuca arundinaceaSchreb.)是一種優(yōu)良的冷季型草坪草，由于它具有抗干旱、耐瘠薄、耐踐踏、綠期長(zhǎng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)，在城市綠化和運(yùn)動(dòng)場(chǎng)地的建設(shè)中被廣泛運(yùn)用。但有些品種抗病性差，如對(duì)褐斑病和銹病等真菌病害較為敏感，嚴(yán)重制約了其草坪質(zhì)量和景觀。運(yùn)用基因工程培育抗病品種能夠解決傳統(tǒng)育種中效率低、周期長(zhǎng)的難題。溶菌酶具有幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的雙重活性，能分解細(xì)菌和真菌細(xì)胞壁組分

2、多糖的β-1，4糖苷鍵，從而裂解病原菌來抵抗病菌的入侵。 該研究以目前廣泛運(yùn)用的獵狗五號(hào)(HuntdogV)、交戰(zhàn)二號(hào)(C：rOSSfireⅡ)、德米尼(Deminion)、王朝(Dynasty)、新秀(Xinxiu)五個(gè)高羊茅新品種的成熟種子為試驗(yàn)材料，優(yōu)化了其愈傷組織再生體系，初步建立了根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，為利用基因工程手段改良高羊茅品種奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1.建立了高羊茅愈傷組織再生體系 (1)

3、首次系統(tǒng)地比較了高羊茅六種外植體即成熟種子、去胚乳種子、去種皮種子、胚軸、幼根、幼葉對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響。研究表明：不同外植體對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)和分化差異顯著。誘導(dǎo)時(shí)以去胚乳種子為最佳外植體，其誘導(dǎo)率平均為76.5％遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它外植體，種子切除胚乳后誘導(dǎo)率比完整種子提高了27.8％。而分化時(shí)胚軸愈傷組織分化率(86.25％)高于去胚乳種子(81.32％)，但胚軸的剝離費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。 (2)以各品種的去胚乳種子為外植體，研究了M

4、S、改良MS(MSM)(MS無機(jī)鹽+水解酪蛋白1mg/L+VB<,1>9.9mg/L+VB<,6>9.5 mg/L+尼克酸4.5mg/L)、CC、NB四種基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、繼代和分化的影響。結(jié)果表明：MSM是愈傷組織誘導(dǎo)的最佳基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率達(dá)到80％～92.5％。但分化時(shí)卻以MS為最佳，在MS+2.5 mg/L KT+2 mg/L6-BA上，五個(gè)品種分化率為66.8％～89.5％，其中以交戰(zhàn)二號(hào)的分化率最高。 (3)

5、本研究探討了外源激素種類及濃度的配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的影響。結(jié)果表明：高羊茅愈傷組織誘導(dǎo)需要較高的2，4-D濃度，多數(shù)品種以9 mg幾為最佳，添加0.5～1mg/L ABA對(duì)發(fā)芽和愈傷組織誘導(dǎo)有強(qiáng)烈抑制作用，出愈率最低為15％。繼代培養(yǎng)基中降低2，4-D濃度同時(shí)添加0.02～0.1mg/L KT，能顯著促進(jìn)胚性愈傷組織的發(fā)生，兩者最佳組合為5mg/L2，4-D+0.1mg/L KT。KT與6-BA配合使用對(duì)愈傷組織分化有增效作用

6、，分化率最高達(dá)89.5％，最佳組合為2.5 mg/L KT+2 mg/L6-BA。 另外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高羊茅不同品種之間愈傷組織誘導(dǎo)、繼代和分化培養(yǎng)中存在明顯差異，說明對(duì)品種進(jìn)行選擇是必要的。 2.進(jìn)行了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高羊茅轉(zhuǎn)基因研究 本研究初步建立了以愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，首次將抗病原菌溶菌酶基因?qū)肓烁哐蛎?。研究結(jié)果表明：選擇初次繼代20d的胚性愈傷組織，用菌液濃度OD<,600>≈0