羊口瘡病毒和山羊痘病毒的分離鑒定及羊口瘡病毒B2L蛋白單克隆抗體的研制.pdf

1、羊口瘡病毒(Orf virus，ORFV)可感染山羊、綿羊和其他野生或家養(yǎng)的小反芻獸引起羊接觸性傳染性膿皰(Contagious ecthyma，CE)，又名羊口瘡(Orf)。雖然感染在1-2月內(nèi)可自行康復(fù)，但繼發(fā)感染和生長(zhǎng)緩慢同樣嚴(yán)重影響?zhàn)B殖業(yè)的發(fā)展。山羊痘病毒(Goatpoxvirus，GTPV)可感染各種年齡、性別、品種的山羊，有報(bào)道稱(chēng)也可感染綿羊，引起急性熱性接觸性山羊痘病，該病最典型的臨床癥狀為皮膚粘膜出現(xiàn)廣泛性痘疹，羔羊、泌

2、乳羊及老年羊發(fā)病嚴(yán)重，后期多因衰竭死亡，孕羊大多發(fā)生流產(chǎn)，嚴(yán)重威脅國(guó)內(nèi)反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)繁殖，是OIE規(guī)定的必須申報(bào)疾病之一，在GTPV流行地區(qū)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　羊口瘡和羊痘在臨床癥狀上十分相似，血清學(xué)診斷又存在交叉反應(yīng)，同時(shí)混合感染也時(shí)有發(fā)生，一般很難快速鑒別，給疾病的治療造成很多不必要的麻煩。本實(shí)驗(yàn)從江蘇地區(qū)部分養(yǎng)殖場(chǎng)（戶(hù)）采集病死羊病料，利用細(xì)胞培養(yǎng)從中分離GTPV和ORFV，通過(guò)PCR、遺傳進(jìn)化分析等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，

3、克隆表達(dá)了ORFV B2L蛋白并制備相應(yīng)的單克隆抗體。取得了如下結(jié)果:
　　1.2013-2015年江蘇部分地區(qū)ORFV和GTPV的分離鑒定
　　共采集羊病料121份，對(duì)其進(jìn)行細(xì)菌分離和病毒分離鑒定。其中ORFV PCR檢測(cè)陽(yáng)性有4份，分別將其命名為 ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China、ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China、 ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/

4、2015/China和ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China。其中有1份是和GTPV混合感染的，擴(kuò)增ORFV B2L基因全長(zhǎng)并繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，XZ株和DT株核酸同源性分別為100.0％、98.6％、98.6％，與SC-JY、GX-YB、JS-FX株聚成一簇，核酸同源性分別為99.9％、100.0％、99.2％和98.5％、98.6％、97.8％。SL株與其他3株核酸同源性分別為98.8％、98.8％、9

5、8.5％，與LiaoNing、HuB、Gansu株親緣關(guān)系接近，核酸同源性分別為98.8％、98.9％、98.9％。4株分離株與中國(guó)疫苗株的核酸同源性為96.8％-98.8％。用胎羊鼻甲骨細(xì)胞(OFTu)和MDBK細(xì)胞系對(duì)其進(jìn)行分離，成功分離出2株。GTPV PCR檢測(cè)陽(yáng)性有2份，將其命名為Goatpox/WX/Jiangsu/2014/China和Goatpox/XZ/Jiangsu/2014/China。2株分離株與EF514890

6、、EF522177、EF514892、HM572329、JN596275、EF514891株等聚成一簇，同源性接近，其中Goatpox/WX/Jiangsu/2014/China與其核酸同源性分別為98.7％-99.1％，Goatpox/XZ/Jiangsu/2014/China與其核酸同源性分別為99.4％-99.5％，與中國(guó)疫苗株的核酸同源性分別為98.6％和99.3％。擴(kuò)增其P32全長(zhǎng)基因繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，與其他地區(qū)分離株

7、核苷酸序列同源性分別為97.3％-100％、97.7％-99.6％。用胎羊睪丸細(xì)胞(LT)和BHK-21細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行分離，成功分離出1株。
　　2.ORFV和GTPV多重PCR檢測(cè)方法的建立
　　選擇羊口瘡病毒和羊痘病毒各自的保守基因P32和VIR，分別設(shè)計(jì)特異性引物，建立多重PCR(mPCR)檢測(cè)方法。該方法特異性和廣譜性較好，提取病料DNA的敏感度結(jié)果顯示，鑒別羊痘、羊口瘡病毒的最低檢出量分別為0.098 ng/μL和0

8、.46 ng/μL，可在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中快速鑒定羊痘、羊口瘡病毒感染或是兩者混合感染。
　　3.ORFV B2L基因的原核表達(dá)
　　克隆ORFV的囊膜蛋白B2L基因，并將其插入pET-32a，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，在37℃、200rpm、0.6M IPTG條件下，融合蛋白B2L-His以可溶性形式大量表達(dá)。經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）純化后，重組蛋白濃度為4.183 mg/mL

9、。
　　4.抗B2L蛋白單克隆抗體的制備
　　以純化的His-B2L融合蛋白免疫六周齡Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行融合，通過(guò)間接ELISA方法篩選出與B2L蛋白反應(yīng)呈陽(yáng)性，與His蛋白反應(yīng)呈陰性的孔進(jìn)行亞克隆，獲得1株能穩(wěn)定分泌抗B2L蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為6D5。IFA結(jié)果顯示，該株單抗與感染ORFV的MDBK細(xì)胞反應(yīng)產(chǎn)生特異性綠色熒光;Western-blot試驗(yàn)結(jié)果表明該株單抗與B2L蛋白