羊口瘡病毒編碼的錨蛋白調節(jié)宿主細胞NF-κB活化的作用研究.pdf

1、目的：病毒感染可引起宿主 NF-κB信號通路的活化，在天然免疫和炎癥反應等抗病毒應答過程中起著至關著重要的作用，研究證明痘病毒編碼的很多錨蛋白能抑制其活化而逃避宿主的免疫應答。為了解析羊口瘡病毒（ORFV）編碼的錨蛋白在調節(jié)宿主細胞NF-κB活化過程中的作用機制，初步探討 ORFV對宿主免疫應答的調節(jié)及入侵宿主細胞的機制。
　　方法：首先，通過生物信息學方法初步預測ORFV錨蛋白結構并分析其生物學特性和功能；其次，通過構建其真核表

2、達載體，轉染293T細胞，利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析篩選對 NF-κB信號活化有明顯調節(jié)作用的錨蛋白，再采用半定量RT-PCR和細胞定位實驗驗證篩選的錨蛋白的一些相關生物學特性和功能；最后，利用Western-blot方法檢測篩選的錨蛋白對NF-κB信號通路IκBα蛋白的總體水平及磷酸化水平的影響，以及對NF-κB p65蛋白核移位的作用。
　　結果：（1）生物學信息分析結果顯示，ORFV編碼的008、123、126、128和

3、129五種錨蛋白具有相似的特征：在N端均含有5～9個ANK基序序列，C末端的F-box-like結構域序列與細胞內的 F-box蛋白在關鍵位點的氨基酸（aa）基本一致，其中ORF126從第155位~177位aa區(qū)域為跨膜區(qū)，ORF128從第433位aa后的“PRRARRL”為核定位序列（NLS）；（2）RT-PCR結果表明，ORFV編碼的008、123、126、128和129五種錨蛋白均在病毒感染宿主細胞前期表達，細胞定位實驗表明ORF

4、123錨蛋白定位于細胞質，ORF126錨蛋白定位于細胞線粒體，ORF128 NLS序列與ANK基序共同介導其編碼的錨蛋白定位于細胞核；（3）雙熒光素酶報告分析結果顯示ORF008、ORF123對NF-κB轉錄因子報告載體熒光素酶活性有極顯著的抑制作用(P<0.01)，ORF128也存在顯著的抑制作用(P<0.05)；（4）Western-blot結果說明ORF008、ORF123能阻止經TNF-α刺激NF-κB活化后IκBα蛋白磷酸化降