TLR4通過活化NF-κB途徑對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能起作用.pdf

1、目的:天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(nTregs,即CD4+CD25+Tregs)是具有顯著免疫抑制功能的T細(xì)胞,不同種類的TLR活化后對其具有不同的作用。為此,體外研究nTregs上膜型TLR4與不同配體結(jié)合后分泌細(xì)胞因子的變化及其對該細(xì)胞抑制功能的影響,初步探討在不同微環(huán)境中TLR4影響nTregs功能的機制。
　　方法:(1)采用磁珠分選出健康人外周血的CD4+CD25+Tregs,并用流式細(xì)胞術(shù)檢測分選的純度。(2)實驗分為兩組,正常

2、CD4+CD25+Tregs(即Non anti-TLR4組)和經(jīng)抗TLR4單抗封閉的CD4+CD25+Tregs(即anti-TLR4組),兩組細(xì)胞分別加入高、中、低不同濃度的LPS(10、1、0.1μg/ml)、HMGB1(1、0.1、0.01μg/ml)刺激培養(yǎng),同時分別設(shè)不加LPS或HMGB1作為對照。采用實時定量PCR檢測各組中IL-1β、IL-10、IFN-γ、TGF-β四種細(xì)胞因子的RNA表達(dá)水平,同時用ELISA檢測細(xì)胞

3、培養(yǎng)上清中上述四種細(xì)胞因子的含量。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)過1μg/ml及10μg/ml LPS、0.1μg/ml及1μg/ml HMGB1不同處理的兩組CD4+CD25+Tregs與CD4+T效應(yīng)細(xì)胞混合培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞的增殖水平。(4)Western-blotting檢測經(jīng)過1μg/ml LPS及1μg/ml HMGB1刺激后兩組CD4+CD25+Tregs的胞漿及胞核蛋白中NF-κB的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1)流式細(xì)胞術(shù)

4、檢測分選得到的CD4+CD25+Tregs純度>82％(84.52±2.10%)(2)HMGB1刺激的CD4+CD25+Tregs在Non anti-TLR4組中IL-1β、IL-10及TGF-β的RNA水平及蛋白含量均較無HMGB1刺激的對照組明顯降低(P<0.05),而anti-TLR4組中較相應(yīng)對照組顯著增高(P<0.05);IFN-γ的RNA水平及蛋白含量變化趨勢與之相反,在Non anti-TLR4組中較對照組增加(P<0.0

5、5),而在anti-TLR4組中明顯低于相應(yīng)對照組(P<0.05)。LPS刺激的CD4+CD25+Tregs在Non anti-TLR4組中IL-1β及IL-10的RNA表達(dá)水平和蛋白含量均較無LPS刺激的對照組顯著增加(P<0.05),而在anti-TLR4組中明顯低于相應(yīng)對照組(P<0.05);IFN-γ及TGF-β在Non anti-TLR4組中RNA表達(dá)水平和蛋白含量均較對照組顯著降低(P<0.05),而在anti-TLR4組中

6、僅IFN-γ的RNA水平與TGF-β明顯高于相應(yīng)對照組(P<0.05),IFN-γ的蛋白含量仍低于對照組(P<0.05)。(3)CD4+CD25+Tregs顯著抑制CD4+T細(xì)胞的增殖,與CD3/CD28抗體活化的陽性對照組相比有差異(P<0.05)。經(jīng)HMGB1刺激的Non anti-TLR4組中,CD4+T細(xì)胞增殖指數(shù)較無HMGB1刺激的對照組略微增高(P<0.05);anti-TLR4組中,CD4+T細(xì)胞增殖指數(shù)較無HMGB1刺激

7、的相應(yīng)對照組明顯降低(P<0.05)。然而,經(jīng)LPS刺激的Non anti-TLR4組中,CD4+T細(xì)胞增殖指數(shù)較無LPS刺激的對照組明顯降低(P<0.05);anti-TLR4組中,CD4+T細(xì)胞增殖指數(shù)較相應(yīng)對照組顯著增加(P<0.05),較陽性對照組亦明顯增加(P<0.05)。(4)Western-blotting結(jié)果顯示:用1μg/ml HMGB1和LPS分別刺激兩組CD4+CD25+Tregs后,Non anti-TLR4組胞

8、漿蛋白中NF-κBp65的含量較無刺激對照組降低,而胞核中則相應(yīng)增加;anti-TLR4組則無明顯改變。
　　結(jié)論:在不同微環(huán)境中,CD4+CD25+Tregs表面的膜型TLR4具有不同的作用,繼而對CD4+CD25+Tregs的抑制功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)經(jīng)TLR4的內(nèi)源性配體HMGB1活化時, CD4+CD25+Tregs以分泌促炎性細(xì)胞因子IFN-γ為主,其抑制功能減弱;當(dāng)與外源性配體LPS相互作用時,IL-1β和IL-10的含量同