高磷通過活化TLR4-NF-κB信號通路誘導(dǎo)血管平滑肌細胞鈣化的實驗研究.pdf

1、雖然中國以及全球的公共衛(wèi)生事業(yè)在不斷的發(fā)展，但是慢性腎臟病(CKD)的發(fā)病率和病死率仍呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，其中很多CKD患者病情得不到有效控制，最終發(fā)展為終末期腎病(ESRD)，并需要接受透析治療或腎移植。CKD除了累及腎臟以外，其它系統(tǒng)的并發(fā)癥也受到越來越多的關(guān)注。在這些并發(fā)癥中，心血管疾病(Cardiovascular diseases，CVD)是CKD患者主要的并發(fā)癥和死亡因素，約占CKD總死亡率的50％以上，因而受到了極大的重視

2、。其中，血管鈣化(VC)是CKD患者的一個重要病變，也是心血管疾病發(fā)病和死亡的獨立危險因素。因此如何防治CKD血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展，具有非常重要的臨床意義。
　　血管鈣化可以隨著人體正常的衰老過程而出現(xiàn)，但是也是某些疾病的常見病變，例如CKD、糖尿病、慢性心力衰竭等。CKD引起的血管鈣化往往為中膜鈣化，既往研究認(rèn)為血管中膜鈣化是鈣-磷酸鹽簡單沉積于血管平滑肌細胞(VSMCs)以及細胞外基質(zhì)引起的，目前的研究則認(rèn)為中膜鈣化是主動的、

3、受基因調(diào)控的過程。VSMCs向成骨細胞轉(zhuǎn)分化被認(rèn)為是血管中膜鈣化的核心環(huán)節(jié)。因此，探索VSMCs向成骨細胞轉(zhuǎn)分化的機制和誘因，可以為防治CKD血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展提供新思路和新靶點就顯得尤為重要了。
　　高磷血癥以及慢性炎癥是CKD患者重要的病理特征，也在CKD及其并發(fā)癥的進展中發(fā)揮著重要作用。高磷血癥雖然常常發(fā)生于CKD4-5期患者，但是血磷的增高往往在CDK早期就已經(jīng)開始了，雖然在FGF23等激素的調(diào)節(jié)下尚能夠保持在正常范圍內(nèi)

4、，血磷增高的損害卻在悄然發(fā)展。目前認(rèn)為高磷血癥是血管鈣化的主要致病因素之一，但是高磷誘導(dǎo)VCMCs轉(zhuǎn)分化為成骨細胞的研究目前尚未完全闡明。研究表明，在體外實驗中炎癥反應(yīng)和炎癥因子（腫瘤壞死因子-α等）可以促進VSMCs轉(zhuǎn)分化為成骨細胞，即炎癥反應(yīng)和血管鈣化呈因果關(guān)系。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)在慢性炎癥中發(fā)揮著重要的作用，白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子都可以由活化

5、的NF-κB激活轉(zhuǎn)錄，而研究發(fā)現(xiàn)TOLL樣受體4(TLR4)則是激活NF-κB的主要信號分子。TLR4主要通過依賴髓樣分化蛋白(MyD88)的途徑激活NF-κB，可促進IκBα與NF-κB解離，使其進入細胞核內(nèi)，由此激活各類炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達。上述這些研究提示高磷血癥和慢性炎癥（TLR4/NF-κB信號通路）都與VSMCs轉(zhuǎn)分化為成骨細胞有著密切的關(guān)系。但是高磷血癥是否可以通過激活TLR4/NF-κB通路誘導(dǎo)血管平滑肌細胞VSMCs轉(zhuǎn)

6、分化和鈣化尚不明確。為此，本實驗以小鼠VSMCs血管平滑肌細胞為主要研究對象，明確高磷在血管鈣化中的關(guān)鍵作用;闡明高磷是否通過激活TLR4/NF-κB信號通路誘導(dǎo)VSMCs轉(zhuǎn)分化為成骨細胞，并導(dǎo)致鈣化。
　　主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　一、高磷誘導(dǎo)VSMCs轉(zhuǎn)分化為成骨細胞并導(dǎo)致鈣化
　　分別使用正常DMEM高糖培養(yǎng)基和含有2.6mmol/L磷酸鹽的DMEM高糖培養(yǎng)基體外培養(yǎng)VSMCs5天。5天后分別行茜素紅S染色觀

7、察VSMCs鈣化情況;Westernblot檢測細胞內(nèi)蛋白表達變化。實驗結(jié)果表明：與正常對照組相比，高磷組VSMCs發(fā)生了明顯的鈣化。VSMCs平滑肌22α(SM22α)的表達明顯下調(diào)，而成骨細胞標(biāo)志物骨形成蛋白2(BMP2)和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)的表達則顯著升高。
　　二、高磷通過激活NF-κB誘導(dǎo)VSMCs向成骨細胞轉(zhuǎn)分化和鈣化
　　為了觀察高磷對NF-κB的影響，同樣采用普通DMEM培養(yǎng)基和含有2.6m

8、mol/L磷酸鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMCs5天。5天后Western blot檢測NF-κB表達變化。實驗結(jié)果表明：與正常對照組相比，高磷組VSMCs的NF-κB(p65)磷酸化明顯增高，說明高磷可以誘導(dǎo)NF-κB活化。為了進一步闡明高磷是否通過NF-κB誘導(dǎo)VSMCs的鈣化，使用NF-κB的抑制劑比咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)預(yù)孵育VSMCs2h后再使用高磷培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMCs，5天后Western blot檢測細胞內(nèi)蛋白表達變化;茜

9、素紅S染色觀察細胞鈣化的情況。實驗結(jié)果表明：與高磷組相比，PDTC+高磷組VSMCs的NF-κB磷酸化明顯受到抑制，即NF-κB的活化被抑制，與此同時BMP2、Runx2等成骨細胞相關(guān)蛋白的表達明顯下調(diào)，平滑肌細胞的標(biāo)志物SM22α的表達則明顯上升。茜素紅S染色結(jié)果也同樣表明，與高磷組相比，PDTC+高磷組VSMCs的鈣化明顯減輕。
　　三、高磷通過激活TLR4/NF-κB信號通路誘導(dǎo)VSMCs向成骨細胞轉(zhuǎn)分化和鈣化
　　為

10、了觀察高磷是否可以激活TLR4/NF-κB信號通路并以此誘導(dǎo)VSMCs的鈣化，首先使用正常培養(yǎng)基和含有2.6mmol/L Pi的培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMCs5天Western blot檢測TLR4蛋白表達的變化。然后使用利用TLR4siRNA干擾TLR4的表達后，再次使用兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)VSMCs5天，5天后采用Western blot檢測細胞內(nèi)蛋白表達變化;茜素紅S染色，觀察細胞鈣化情況。實驗結(jié)果表明：高磷可以導(dǎo)致VSMCs內(nèi)TLR4表達明顯增

11、高，提示TLR4可能參與了高磷誘導(dǎo)血管鈣化的過程。而使用TLR4siRNA抑制VSMCs TLR4的表達后，即使仍使用高磷培養(yǎng)基培養(yǎng)，但高磷導(dǎo)致的NF-κB磷酸化明顯受到抑制;與高磷組相比，TLR4siRNA+高磷組VSMCs平滑肌細胞標(biāo)志物SM22α的表達明顯升高，成骨細胞相關(guān)蛋白BMP2和Runx2的表達顯著下降。茜素紅S染色提示，TLR4siRNA抑制TLR4的表達后，高磷誘導(dǎo)的VSMCs鈣化程度明顯降低。
　　綜上所述，我