NF-κB活化在900MHz微波輻射通過活性氧誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)中的作用研究.pdf

1、目的：
　　以原代小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞為研究對象，建立低劑量微波輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)細(xì)胞模型，分析低劑量微波輻射與ROS產(chǎn)生及NF-κB活化的相關(guān)性，探討低劑量微波輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)的可能機(jī)理。
　　方法：
　　1.低劑量微波輻射誘導(dǎo)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)模型的建立
　　制備小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為6組：對照組、微波照射組（900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)5d）、假照射組（細(xì)胞置于微波輻

2、照裝置中，不給予微波照射）、γ射線照射組（1.5 Gy60Co-γ射線照射，劑量率0.376 Gy/min）、微波復(fù)合組（900MHz,120μW/cm2微波照射，4h/d，連續(xù)5d，照射結(jié)束4小時后給予1.5 Gy60Co-γ射線照射）、假照射復(fù)合組（假照射結(jié)束4小時后給予1.5 Gy60Co-γ射線照射）。γ射線照射結(jié)束后，立即收集細(xì)胞，用堿性單細(xì)胞凝膠電泳實驗和γ-H2AX焦點形成試驗檢測細(xì)胞DNA單、雙鏈損傷。
　　2.

3、ROS在低劑量微波輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)中的作用
　　（1）低劑量微波輻射誘導(dǎo)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生ROS：制備小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為6組：對照組、褪黑素組（500nM褪黑素處理細(xì)胞）、微波照射組（900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)5d）、假照射組（細(xì)胞置于微波輻照裝置中，不給予微波照射）、褪黑素+微波組（500nM褪黑素處理細(xì)胞，4小時后給予900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)5d）、

4、H2O2組【培養(yǎng)液中1:1000（V/V）濃度加入 H2O2，處理細(xì)胞20~30分鐘】，處理結(jié)束后立即收集細(xì)胞，用試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　?。?）ROS在低劑量微波輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)中的作用：制備小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為6組：對照組、微波照射組（900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)5d）、褪黑素+微波組（500nM褪黑素處理細(xì)胞，4小時后給予900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)

5、5d）、γ射線照射組（1.5 Gy60Co-γ射線照射，劑量率0.376 Gy/min）、微波復(fù)合組（900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)5d，照射結(jié)束4小時后給予1.5 Gy60Co-γ射線）、褪黑素+微波+γ射線組（500nM褪黑素處理細(xì)胞，4小時后給予900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)5d，微波照射結(jié)束4小時后給予1.5 Gy60Co-γ射線）。照射結(jié)束后，立即進(jìn)行堿性單細(xì)胞凝膠電泳實

6、驗和γ-H2AX焦點形成試驗，檢測細(xì)胞DNA單、雙鏈損傷。
　　3. NF-κB活化在低劑量微波輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)中的作用
　　（1）低劑量微波輻射誘導(dǎo)NF-κB活化：制備小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為3組：對照組、微波照射組（900MHz,120μW/cm2的微波輻照，4h/d，連續(xù)5d）、假照射組（細(xì)胞置于微波輻照裝置中，不給予微波照射）。于微波照射結(jié)束后0、0.5、1、2、4、6小時收集細(xì)胞，提取細(xì)胞胞漿和胞核蛋白，用Ws

7、etern Blot檢測NF-κB表達(dá)水平。
　?。?）NF-κB活化在低劑量微波輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)中的作用：制備小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為6組：對照組、微波照射組（900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)5d）、BAY11-7082+微波組（10μM BAY11-7082處理30分鐘，然后給予900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)5d）、γ射線照射組（1.5 Gy60Co-γ射線照射，劑量率

8、0.376 Gy/min）、微波復(fù)合組（900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)5d，照射結(jié)束4小時后給予1.5 Gy60Co-γ射線）、BAY11-7082+微波+γ射線組（10μM BAY11-7082處理細(xì)胞，30分鐘后給予900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)5d，微波照射結(jié)束4小時后給予1.5 Gy60Co-γ射線照射）。照射結(jié)束后立即進(jìn)行堿性單細(xì)胞凝膠電泳實驗和γ-H2AX焦點形成試驗檢

9、測細(xì)胞DNA單、雙鏈斷裂。
　　4. ROS在低劑量微波輻射誘導(dǎo)的NF-κB活化中的介導(dǎo)作用：制備小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞，隨機(jī)分為3組：對照組、褪黑素+微波組（500nM褪黑素處理細(xì)胞，4小時后給予900MHz,120μW/cm2的微波照射，4h/d，連續(xù)5d）、假照射組（細(xì)胞置于微波照射裝置中，不給予微波照射）。微波照射結(jié)束后0、0.5、1、2、4、6小時收集細(xì)胞，提取細(xì)胞胞漿和胞核蛋白，Wsetern Blot檢測NF-κB表達(dá)水平

10、。
　　結(jié)果：
　　1.低劑量微波輻射誘導(dǎo)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞適應(yīng)性反應(yīng)模型的建立
　?。?）與對照組相比，假照射組細(xì)胞彗星尾長、尾距及γ-H2AX焦點形成數(shù)量均無顯著變化（P>0.05）；與單純γ射線照射組相比，假照射與γ射線復(fù)合組細(xì)胞彗星尾長、尾距及γ-H2AX焦點形成數(shù)量均無顯著變化（P>0.05），說明微波假照射對DNA損傷無明顯影響。（2）與對照組相比，微波照射組細(xì)胞彗星尾長、尾距及γ-H2AX焦點形成數(shù)量均無明

11、顯變化（P>0.05），γ射線照射組細(xì)胞尾長、尾矩明顯增大（P<0.0001），γ-H2AX焦點形成數(shù)量明顯增加（P<0.0001），說明微波照射對DNA損傷無明顯影響，而γ射線暴露可導(dǎo)致明顯的DNA單鏈和雙鏈損傷。（3）與單純γ射線照射組相比，微波復(fù)合組細(xì)胞彗星尾長、尾距明顯減?。≒<0.0001），γ-H2AX焦點形成數(shù)量明顯降低（P<0.0001），說明低劑量微波輻射能夠誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)，拮抗γ射線暴露導(dǎo)致的DNA單鏈和雙鏈損傷。<

12、br>　　2. ROS在低劑量微波輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)中的作用
　?。?）與對照組相比，褪黑素組和假照射組細(xì)胞內(nèi) ROS水平均無顯著變化（P>0.05），說明褪黑素和微波假照射對細(xì)胞內(nèi)ROS水平無明顯影響。（2）與對照組相比，微波照射組和H2O2組細(xì)胞內(nèi)ROS水平均顯著升高（P<0.01），說明微波照射和H2O2處理可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高。（3）與微波組相比，褪黑素+微波組細(xì)胞內(nèi) ROS水平顯著降低（P<0.05），說明褪黑

13、素預(yù)處理能明顯清除細(xì)胞內(nèi)微波誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS。（4）與對照組相比，微波照射組、褪黑素+微波組細(xì)胞彗星尾長、尾距及γ-H2AX焦點形成數(shù)量均無顯著變化（P>0.05），γ射線照射組細(xì)胞尾長、尾矩明顯增大（P<0.01），γ-H2AX焦點形成數(shù)量明顯增多（P<0.0001），說明微波照射和褪黑素對DNA損傷無明顯影響，而γ射線暴露可導(dǎo)致明顯的DNA單鏈和雙鏈損傷。（5）與單純γ射線照射組相比，微波與γ射線復(fù)合照射組細(xì)胞彗星尾長、尾距及γ-H

14、2AX焦點形成數(shù)量均有顯著變化（P<0.0001），說明低劑量微波輻射能夠誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)，拮抗γ射線暴露導(dǎo)致的DNA單鏈和雙鏈損傷。（6）與微波復(fù)合照射組相比，褪黑素+微波+γ射線組細(xì)胞彗星尾長、尾距明顯增大（P<0.01），γ-H2AX焦點形成數(shù)量明顯增多（P<0.0001），說明褪黑素預(yù)處理后再給予微波+γ射線照射可抑制微波誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)產(chǎn)生。
　　3. NF-κB活化在低劑量微波輻射誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)中的作用
　?。?）與

15、對照組相比，假照射組細(xì)胞胞漿和胞核中 NF-κB水平均無顯著變化（P>0.05），說明微波假照射對NF-κB活化無顯著影響。（2）與對照組相比，微波照射組胞核內(nèi)NF-κB隨照射后時間增加而升高（P<0.01），胞漿內(nèi)NF-κB表達(dá)水平隨時間增加而降低，說明微波誘導(dǎo)NF-κB的活化，活化后的NF-κB由細(xì)胞漿移位進(jìn)入細(xì)胞核。（3）與微波組相比，BAY11-7082+微波組胞漿和胞核內(nèi)NF-κB水平均明顯降低（P<0.01），說明NF-κB

16、抑制劑BAY11-7082預(yù)處理可抑制微波誘導(dǎo)NF-κB活化。（4）與對照組相比，微波照射組、BAY11-7082+微波組細(xì)胞彗星尾長、尾距及γ-H2AX焦點形成數(shù)量均無顯著差異（P>0.05），γ射線照射組細(xì)胞尾長、尾矩明顯增大（P<0.0001），γ-H2AX焦點形成數(shù)量明顯增多（P<0.0001），說明微波照射和NF-κB抑制劑BAY11-7082對DNA損傷無明顯影響，而γ射線暴露可導(dǎo)致明顯的DNA單鏈和雙鏈損傷。（5）與單純γ

17、射線照射組相比，微波復(fù)合照射組細(xì)胞彗星尾長、尾距及γ-H2AX焦點形成數(shù)量均有顯著差異（P<0.0001），說明低劑量微波輻射能夠誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)，拮抗γ射線暴露導(dǎo)致的DNA單鏈和雙鏈損傷。（6）BAY11-7082+微波+γ射線組與微波復(fù)合照射組相比，細(xì)胞彗星尾長、尾距明顯增大（P<0.01），γ-H2AX焦點形成數(shù)量明顯增多（P<0.0001），說明NF-κB抑制劑預(yù)處理后再給予微波+γ射線照射可抑制微波誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)產(chǎn)生。
　

18、　4. ROS在低劑量微波輻射誘導(dǎo)的NF-κB活化中的介導(dǎo)作用
　　（1）與對照組相比，假照射組細(xì)胞胞漿和胞核中 NF-κB水平均無顯著變化（P>0.05），說明微波假照射對NF-κB活化無明顯影響。（2）與對照組相比，褪黑素+微波組胞核內(nèi)NF-κB隨照射后時間增加并無顯著變化（P>0.05），說明褪黑素預(yù)處理后再給予微波照射可通過抑制微波誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，繼而抑制NF-κB活化。
　　結(jié)論：
　　1.預(yù)先給予900MH