貴州山羊痘病毒抗凋亡毒力因子基因的克隆及鑒定.pdf

1、本文以貴州分離的山羊痘病毒為實驗材料，研究山羊痘病毒在體外感染敏感細(xì)胞的致細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步研究了與細(xì)胞凋亡相關(guān)的重要因子—山羊痘病毒抗凋亡毒力因子(Goatpox virus antiapoptosis virulence factor，GTPV-AVF)的基因，分析抗凋亡毒力因子基因的mRNA動力學(xué)變化。采用倒置顯微鏡觀察感染細(xì)胞形態(tài)病變，苔盼蘭染色統(tǒng)計細(xì)胞的死亡率，吖啶橙(AO)/溴乙錠(EB)熒光染色觀察凋亡細(xì)胞，并統(tǒng)計

2、細(xì)胞凋亡率，提取病毒感染凋亡細(xì)胞DNALadder，應(yīng)用PCR技術(shù)克隆了抗凋亡毒力因子基因并對其進(jìn)行測序，NCBI在線分析核苷酸序列及編碼蛋白的相似性，推測了編碼蛋白的性質(zhì)及功能，RT-PCR分析抗凋亡毒力因子基因mRNA在病毒感染期間的動力學(xué)變化。山羊痘病毒感染Vero細(xì)胞36小時開始有細(xì)胞變圓，細(xì)胞間出現(xiàn)拉網(wǎng)、集聚成葡萄狀，48小時開始時出現(xiàn)細(xì)胞脫落，細(xì)胞死亡率36小時高達(dá)80％，48小時達(dá)到100％，但是細(xì)胞凋亡率在48小時僅為1

3、3％，凋亡細(xì)胞DNALadder有較弱的Ladder現(xiàn)象，說明感染的細(xì)胞有凋亡發(fā)生，但是凋亡率不高。克隆得到了抗凋亡毒力因子基因為531個核苷酸的DNA序列，分析了該基因的性質(zhì)及功能。對抗凋亡毒力因子基因mRNA動力學(xué)變化分析顯示，基因mRNA的表達(dá)量隨感染時間的增加而增加，在病毒感染24小時時達(dá)到最大值，隨后表達(dá)量下降，這一變化可能與病毒感染細(xì)胞凋亡的發(fā)生有某種聯(lián)系。提示山羊痘病毒抗凋亡毒力因子在山羊痘病毒與細(xì)胞之間的相互作用中起重要