羊痘病毒(GTPV)高效表達(dá)載體的構(gòu)建及其鑒定.pdf

1、目的：山羊痘病毒（GTPV)為痘病毒科,羊痘病毒屬的一個(gè)成員,基因組呈線性,全長(zhǎng)約150 kb ,編碼147個(gè)開放閱讀框，是牛、羊等重大傳染病重組活疫苗的理想載體。由于插入的外源基因表達(dá)量低--啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性低，本研究旨于構(gòu)建一個(gè)能夠高效表達(dá)外源基因的山羊痘病毒（GTPV）表達(dá)載體。方法：預(yù)測(cè)GTPV基因組中早期轉(zhuǎn)錄因子VETF-l和中期轉(zhuǎn)錄因子VITF-3基因序列之間56 bp的一段序列為一雙向啟動(dòng)子，兩個(gè)方向分別命名為Pb56(-)

2、，Pb56(+)。通過PCR技術(shù)將該啟動(dòng)子的兩個(gè)方向分別與綠色熒光蛋白（EGFP）報(bào)告基因融合，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體，分別命名為Puc-TK12-Pb56(+)-EGFP,Puc-TK12-Pb56(-)-EGFP。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將2個(gè)轉(zhuǎn)移載體以及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)移載體Puc-TK12-EGFP，標(biāo)準(zhǔn)載體Puc-TK12-P7.5-EGFP分別與GTPV共轉(zhuǎn)染至BHK細(xì)胞；采用EGFP報(bào)告基因系統(tǒng)通過熒光共聚焦顯微鏡，流式細(xì)胞儀，熒光實(shí)時(shí)定量PCR等

3、技術(shù)鑒定雙向啟動(dòng)子并對(duì)其活性進(jìn)行了定量的測(cè)定。將布魯氏菌的外膜蛋白蛋白基因omp25作為外源基因插入到驗(yàn)證好的雙向啟動(dòng)子后，構(gòu)建載體命名為Puc119-TK-Pb56(-)-omp25，通過Western-blotting對(duì)外源基因的表達(dá)活性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：該基因序列的兩個(gè)方向均能啟動(dòng)EGFP的表達(dá)，初步證實(shí)了該基因序列為一GTPV的雙向啟動(dòng)子；Pb56(-)，Pb56(+)的轉(zhuǎn)錄活性均高于痘苗病毒（VV）的P7.5啟動(dòng)子；外源基因om