山羊痘病毒基因缺失重組毒株的構(gòu)建與生物學(xué)特性鑒定.pdf

1、山羊痘是一種急熱性傳染病，由山羊痘病毒(goatpoxvirus，GTPV)引發(fā)，臨床上以出現(xiàn)發(fā)熱和全身起痘為典型特征，具有很高的發(fā)病率和死亡率。我國目前使用山羊痘弱毒疫苗AV41株來預(yù)防山羊痘，但其在我國部分省份尤其是南方部分地區(qū)的羊痘防疫過程中，發(fā)現(xiàn)存在有安全隱患，可產(chǎn)生諸多不良反應(yīng)，如全身發(fā)痘、孕羊流產(chǎn)等。因此，有必要進(jìn)一步研制更為安全有效的新型基因工程疫苗。
　　 本研究利用分子生物學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)等方面的技術(shù)和手段，

2、以GTPV弱毒疫苗毒株AV41為模板，分別設(shè)計(jì)4對引物，PCR擴(kuò)增ORF5～ORF19和ORF149～ORF15兩個區(qū)域兩側(cè)共四個基因組片段，分別作為同源重組左側(cè)臂和右側(cè)臂；運(yùn)用分子技術(shù)，分別將兩側(cè)重組臂相連，并在兩個重組臂中間插入報(bào)告基因EGFP和篩選基因gpt的表達(dá)盒，構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pLF-Eg和pRF-Eg;分別將轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pLF-Eg和pRF-Eg與GTPVAV41株共轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎細(xì)胞(Vero細(xì)胞)，使其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源

3、重組，加壓篩選并純化重組GTPV;最后鑒定重組GTPV和檢測其生物學(xué)特性。
　　 通過一系列實(shí)驗(yàn)研究，確定了GTPV基因組中的兩個病毒復(fù)制非必需區(qū)，分別成功構(gòu)建了敲除掉GTPV毒力相關(guān)基因ORF5～ORF19之間共15個ORF和ORF149～ORF151之間共3個ORF的兩株重組山羊痘弱毒株。同時證實(shí)這兩個基因重組缺失毒株均可穩(wěn)定遺傳，并保持了親本毒株在細(xì)胞培養(yǎng)物中的生長特性。這為研制更安全、高效的山羊痘基因工程弱毒疫苗奠定基礎(chǔ)