山羊痘病毒Vero細(xì)胞適應(yīng)毒的培育和基于P32蛋白的單克隆抗體制備.pdf

1、山羊痘病毒(Goatpox virus，GTPV)為急性接觸性傳染病，可感染各種年齡、性別和品種的山羊，造成山羊發(fā)熱、皮膚丘疹和黏膜臟器廣泛性的痘疹等臨床癥狀，導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降，嚴(yán)重威脅國(guó)內(nèi)外養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。目前我國(guó)防控該病的主要措施是疫苗免疫的方法，但仍時(shí)有疫情發(fā)生，因此，建立快速診斷該病方法是十分必要的。本研究將在原代胎羊睪丸細(xì)胞分離的GTPV-XZ株在Vero細(xì)胞進(jìn)行傳代，同時(shí)克隆表達(dá)GTPV P32蛋白，免疫小鼠制備單抗，為建立快

2、速，操作簡(jiǎn)便、成本低廉的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。
　　1.GTPV Vero細(xì)胞適應(yīng)毒的培育
　　將分離的山羊痘病毒轉(zhuǎn)接到Vero細(xì)胞上進(jìn)行連續(xù)傳代，通過20代的傳代培養(yǎng)，細(xì)胞的CPE趨于穩(wěn)定，接毒3d后，細(xì)胞皺縮拉網(wǎng)，形成許多聚集的細(xì)胞團(tuán)塊，5d后細(xì)胞開始脫落，在病變達(dá)到80％的時(shí)候進(jìn)行收獲，繼續(xù)傳代。選取每一代病毒測(cè)定TCID50，同時(shí)繪制了GTPV P32基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用qRT-PCR對(duì)每代病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示前期病毒在V

3、ero細(xì)胞上的增殖含量較低，通過連續(xù)20代培養(yǎng)之后GTPV的增殖滴度小幅提高并趨于穩(wěn)定，因此獲得了Vero細(xì)胞適應(yīng)毒。
　　2.GTPV P32基因的原核表達(dá)
　　通過克隆P32基因，并將其插入pET-32a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21后用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，在37℃、220rpm、1M IPTG條件下，融合蛋白P32-His能以可溶性形式大量表達(dá)。經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化后，獲得可溶性

4、的重組蛋白濃度為2.5 mg/mL。使用純化的P32蛋白免疫BALB/c小鼠制備多抗血清，通過IFA試驗(yàn)結(jié)果顯示:制備多抗血清能與感染GTPV的Vero細(xì)胞產(chǎn)生特異性的熒光，表明重組的P32蛋白有較好的免疫原性，為下一步進(jìn)行P32蛋白單克隆抗體的制備提供材料。
　　3.抗GTPV P32蛋白單克隆抗體的制備
　　使用純化的P32-His融合蛋白免疫六周齡BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行融合，通過間接ELI