山羊痘病毒Vero細胞適應(yīng)毒的培育和基于P32蛋白的單克隆抗體制備.pdf

1、山羊痘病毒(Goatpox virus，GTPV)為急性接觸性傳染病，可感染各種年齡、性別和品種的山羊，造成山羊發(fā)熱、皮膚丘疹和黏膜臟器廣泛性的痘疹等臨床癥狀，導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降，嚴重威脅國內(nèi)外養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。目前我國防控該病的主要措施是疫苗免疫的方法，但仍時有疫情發(fā)生，因此，建立快速診斷該病方法是十分必要的。本研究將在原代胎羊睪丸細胞分離的GTPV-XZ株在Vero細胞進行傳代，同時克隆表達GTPV P32蛋白，免疫小鼠制備單抗，為建立快

2、速，操作簡便、成本低廉的檢測奠定基礎(chǔ)。
　　1.GTPV Vero細胞適應(yīng)毒的培育
　　將分離的山羊痘病毒轉(zhuǎn)接到Vero細胞上進行連續(xù)傳代，通過20代的傳代培養(yǎng)，細胞的CPE趨于穩(wěn)定，接毒3d后，細胞皺縮拉網(wǎng)，形成許多聚集的細胞團塊，5d后細胞開始脫落，在病變達到80％的時候進行收獲，繼續(xù)傳代。選取每一代病毒測定TCID50，同時繪制了GTPV P32基因的標準曲線，使用qRT-PCR對每代病毒進行檢測，結(jié)果顯示前期病毒在V

3、ero細胞上的增殖含量較低，通過連續(xù)20代培養(yǎng)之后GTPV的增殖滴度小幅提高并趨于穩(wěn)定，因此獲得了Vero細胞適應(yīng)毒。
　　2.GTPV P32基因的原核表達
　　通過克隆P32基因，并將其插入pET-32a表達載體上，轉(zhuǎn)化表達菌株BL21后用IPTG誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE檢測結(jié)果顯示，在37℃、220rpm、1M IPTG條件下，融合蛋白P32-His能以可溶性形式大量表達。經(jīng)His標簽蛋白純化試劑盒純化后，獲得可溶性

4、的重組蛋白濃度為2.5 mg/mL。使用純化的P32蛋白免疫BALB/c小鼠制備多抗血清，通過IFA試驗結(jié)果顯示:制備多抗血清能與感染GTPV的Vero細胞產(chǎn)生特異性的熒光，表明重組的P32蛋白有較好的免疫原性，為下一步進行P32蛋白單克隆抗體的制備提供材料。
　　3.抗GTPV P32蛋白單克隆抗體的制備
　　使用純化的P32-His融合蛋白免疫六周齡BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0進行融合，通過間接ELI