羊促乳素單克隆抗體的制備和鑒定.pdf

1、促乳素(prolactin，PRL)為腺垂體促乳素細(xì)胞分泌的肽類激素，在人類和動(dòng)物生殖中主要生理作用為促進(jìn)乳腺發(fā)育、啟動(dòng)泌乳和維持泌乳。在家畜，尤其是在羊的繁殖生產(chǎn)中，產(chǎn)后生理性的高促乳素水平會(huì)抑制卵巢功能，表現(xiàn)為卵巢上無(wú)卵泡發(fā)育和排卵，而使母羊產(chǎn)后哺乳期間不能配種妊娠，從而使羊的產(chǎn)羔間隔延長(zhǎng)。在肉羊生產(chǎn)中，提高養(yǎng)殖效益的最有效的途徑之一就是盡可能地縮短母羊產(chǎn)羔間隔。而縮短產(chǎn)羔間隔最有效的措施，就是在早期斷奶和改善母羊營(yíng)養(yǎng)狀況等措施的基

2、礎(chǔ)上，盡快降低母羊促乳素水平、恢復(fù)卵巢活動(dòng)。已有研究者采用溴隱亭有效降低促乳素水平，促進(jìn)母羊卵巢功能的恢復(fù)和發(fā)情?？焖俳档湍秆蝮w內(nèi)促乳素分泌的另一條途徑就是使用促乳素多克隆或單克隆抗體。 利用羊促乳素純品和Freund佐劑作為免疫原，采用常規(guī)的免疫程序，間接ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，分別在第1天，15天和29天免疫三次后，血清抗體效價(jià)1:8 000～1:10 000之間，表明抗原的免疫原性很好，第四次加強(qiáng)免疫后3 d，脾細(xì)胞可用于

3、細(xì)胞融合。 為了篩選分泌抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，以促乳素免疫過(guò)的BALB/C小鼠血清為陽(yáng)性對(duì)照，以未免疫的BALB/C小鼠血清為陰性對(duì)照，通過(guò)對(duì)ELISA檢測(cè)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)羊促乳素抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，其主要條件如下：pH9.6，0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖溶液(CBS)為包被液，0.1μg/mL的抗原為包被抗原，1％BSA為封閉液，1:200為血清的最佳稀釋倍數(shù)，1:10 000.為酶標(biāo)二抗最佳工作濃度，90

4、 min為酶標(biāo)二抗作用時(shí)間，30 min為底物作用時(shí)間。試驗(yàn)證明本法特異性強(qiáng)，有較好的重復(fù)性。用該法對(duì)促乳素免疫小鼠的血清抗體及其雜交瘤細(xì)胞單抗上清進(jìn)行檢測(cè)。 以1mL40％聚乙二醇4 000(PEG 4 000)為融合劑，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按照1:5-1:10的比例在室溫下進(jìn)行融合，整個(gè)融合過(guò)程控制在1min，盡量保持勻速，然后在3 min內(nèi)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液8 mL稀釋PEG，速度為先慢后快，使其失去

5、促融作用，離心，洗滌后，融合后的細(xì)胞用HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，融合后每3 d～4 d半量換液一次，在融合后第3天出現(xiàn)小的克隆，第7天雜交瘤細(xì)胞鋪滿孔底50％，用建立的間接ELISA法篩選陽(yáng)性孔，克隆率為69％，陽(yáng)性克隆率為23％。 陽(yáng)性培養(yǎng)孔篩選結(jié)束后，采用有限稀釋法篩選陽(yáng)性克隆，通過(guò)誘生腹水法制備單克隆抗體，并用核型分析對(duì)雜交瘤細(xì)胞的染色體進(jìn)行初步鑒定。通過(guò)細(xì)胞融合，獲得五株能穩(wěn)定分泌抗促乳素特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命