饑餓誘導的自噬在多發(fā)性骨髓瘤細胞中的特點及冬凌草甲素作用的機制研究.pdf

1、第一部分、mTOR 信號通路負調(diào)控的自噬在饑餓早期保護多發(fā)性骨髓瘤細胞抵抗凋亡
　　 目的：本研究利用饑餓誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞同時發(fā)生自噬和凋亡，觀察兩者的生物學特征以及相互關(guān)系，探討所涉及的分子機制，明確饑餓時多發(fā)性骨髓瘤細胞中自噬的生物學特征。
　　 方法：在正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞至對數(shù)生長期，然后完全去除培養(yǎng)基內(nèi)的胎牛血清誘導細胞饑餓狀態(tài)。利用3-甲基腺素(3-Methyladenine，

2、3-MA)抑制自噬。利用MTT 比色法檢測經(jīng)實驗處理后細胞的增殖活性。分別利用以下技術(shù)檢測經(jīng)實驗處理后的細胞內(nèi)的自噬水平：MDC(monodansylcadaverine)熒光染色劑熒光標記自噬并用流式細胞術(shù)測定熒光強度，western blot免疫印記技術(shù)檢測自噬標記蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)Ⅰ向LC3Ⅱ的蛋白轉(zhuǎn)化水平以及Beclin 1 蛋白表達水平，RT-PCR和qRT-PCR檢測Beclin 1的mRNA水平，利用透射電

3、鏡(TEM)直接觀察自噬小體的形成和數(shù)量。
　　 利用Annexin V-FITC/PI 流式細胞術(shù)和TUNEL 檢測細胞凋亡，利用TEM 直接觀察胞內(nèi)凋亡的典型形態(tài)學變化。利用western blot 免疫印記技術(shù)S6K1的磷酸化水平、活化caspase 3 蛋白水平、Bax 從胞漿向線粒體的轉(zhuǎn)位水平。分別利用RT-PCR和quantitative RT-PCR(qRT-PCR)檢測Beclin 1和Bax的mRNA 水平。利

4、用SPSS13.0 進行統(tǒng)計分析，p<0.05具有統(tǒng)計學差異。
　　 結(jié)果：饑餓誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞發(fā)生自噬，自噬在饑餓6h，12h和18h 呈現(xiàn)時間依賴性上升，自噬在18h 達到最高水平，隨后在24h和48h 出現(xiàn)下降，并在48h 回落至基礎(chǔ)水平，該過程受mTORC1 通路的負性調(diào)控；饑餓誘導細胞發(fā)生隨時間時間逐漸上升的凋亡，并在饑餓24h 自噬出現(xiàn)下降時凋亡顯著增加，伴隨凋亡的Bax 轉(zhuǎn)位和caspase 3 活化說明饑餓誘

5、導細胞發(fā)生線粒體依賴的典型凋亡；3-MA 抑制自噬后，饑餓6h，12h和18h的細胞凋亡和caspase 3 活化增加，而24h和48h 兩者無明顯變化。
　　 結(jié)論：饑餓能同時誘導RPMI8226細胞發(fā)生自噬和凋亡；自噬主要發(fā)生在饑餓早期并抑制凋亡的發(fā)生保護腫瘤細胞生存，隨著饑餓的持續(xù)，細胞最終走向凋亡；凋亡為RPMI8226細胞死亡的主要方式；mTORC1 通路參與了自噬的調(diào)控。
　　 第二部分、饑餓誘導多發(fā)性骨髓瘤

6、細胞發(fā)生時間依賴的自噬和凋亡的分子機制探討
　　 目的：前文已經(jīng)證實了饑餓同時誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞系細胞發(fā)生自噬和凋亡；自噬與凋亡呈現(xiàn)時間依賴性的變化，饑餓0h，6h，12h，18h 時自噬和凋亡呈現(xiàn)時間依賴性增加，其中自噬增加明顯，而凋亡增加較輕微，而饑餓24h和48h自噬下降，與此同時凋亡爆發(fā)；同時發(fā)現(xiàn)自噬受mTORC 負調(diào)控，而凋亡則是caspase-3 介導Bax 依賴的經(jīng)典凋亡途徑。本研究的目的是進一步探討其細胞分子信

7、號機制。
　　 方法：用qRT-PCR和RT-PCR檢測了饑餓0h、6h、12h、18h、24h和48h Deptor、Raf-1、JNK1、JNK2、JNK3、p53、p21以及NFκB1的轉(zhuǎn)錄水平；利用SPSS13.0統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。
　　 結(jié)果：在RPMI8226細胞中Raf-1、JNK1、JNK2、NFκB1和p21 高度表達，Deptor和p53中度表達，JNK3 低度表達。Deptor 轉(zhuǎn)錄水平與自噬變化一致在

8、0h、6h、12h和18h 呈現(xiàn)時間依賴性升高繼而在24h和48h下降；Raf-1、JNK1、JNK2、p53、p21 轉(zhuǎn)錄水平與凋亡變化一致在0h、6h、12h、18h、24h和48h 呈現(xiàn)時間依賴性升高，24h和48h 增加更為明顯；NFκB1 各時間點轉(zhuǎn)錄水平較0h下降但并未呈現(xiàn)時間依賴性。
　　 結(jié)論：上述信號分子均參與了饑餓時細胞反應，Deptor 主要促進細胞自噬，Raf-1/JNK/p53/p21與細胞凋亡密切相關(guān)

9、，而NFκB1 抑制細胞凋亡。Deptor是否同時參與調(diào)控了細胞自噬和凋亡仍有待證實。
　　 第三部分、冬凌草甲素誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞發(fā)生自噬和凋亡的機制研究
　　 目的：本實驗主要研究冬凌草甲素誘導多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生自噬、凋亡，兩者之間的關(guān)系以及所涉及的相關(guān)機制。
　　 方法：利用MTT 比色法檢測冬凌草甲素對多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細胞的增殖活性影響；透視電鏡觀察細胞內(nèi)凋亡和自噬的形態(tài)學改變；Annexin

10、 V-FITC/PI流式細胞術(shù)和TUNEL 檢測細胞凋亡；分別利用以下技術(shù)檢測處理后的細胞內(nèi)的自噬變化：使用QDs605nm-Anti-LC3 熒光探針以及免疫熒光技術(shù)定位細胞胞內(nèi)LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白，利用western blot 免疫印記技術(shù)檢測LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化水平；利用DCFH-DA 探針以及流式細胞術(shù)檢測細胞胞內(nèi)ROS 水平；western blot免疫印記技術(shù)檢測細胞active caspase 3和Beclin 1表達

11、水平以及SIRT1 核蛋白表達水平。
　　 結(jié)果：冬凌草甲素能明顯抑制RPMI8226細胞增殖，其抑制作用呈時間、劑量依賴性；冬凌草甲素能同時誘發(fā)呈時間依賴性升高的凋亡和自噬，然而，caspase3依賴的凋亡是冬凌草甲素誘導細胞死亡的主要方式；與此同時，冬凌草甲素誘導呈時間依賴性的細胞胞內(nèi)ROS 水平升高以及SIRT1 核蛋白表達下降；用NAC完全抑制胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生后，冬凌草甲素無法再誘發(fā)凋亡和自噬，也逆轉(zhuǎn)了冬凌草甲素對SIR