Dickkopf1在多發(fā)性骨髓瘤中的作用.pdf

1、第一部分DKK1在多發(fā)性骨髓瘤中的臨床研究 目的：研究MM患者骨髓上清液及血清Dickkopf1(DKK1)水平，及其與骨髓瘤分期、溶骨性病變的關系，以及不同化療方案對DKK1的影響及與療效的關系，探討DKK1在多發(fā)性骨髓瘤中的臨床作用。 方法：采用雙抗體夾心酶標免疫分析法(ELISA)檢測80例初診MM患者、10例MGUS患者及20例對照骨髓上清液及血清DKK1水平，以及檢測136例接受硼替佐米+地塞米松或沙利度胺+地

2、塞米松治療的MM患者化療前后血清DKK1水平。 結(jié)論：MM患者DKK1水平明顯高于MGUS患者及對照組，而且DKK1水平與骨髓瘤分期及溶骨性病變密切相關，能反映溶骨性病變的程度和范圍。DKK1水平在化療有效時明顯下降，但與化療方案有關，硼替佐米能使DKK1水平明顯下降，而沙利度胺及地塞米松卻無此作用。 第二部分骨髓瘤細胞與基質(zhì)細胞DKK1相關受體LRP5/6及Kremen1/2基因轉(zhuǎn)錄水平的研究 目的：比較骨髓瘤

3、細胞系、CD138+原代骨髓瘤細胞、MM患者及正常人基質(zhì)細胞LRP5/6、Kremen1/2及β-cateninmRNA水平，研究骨髓瘤細胞或重組DKK1蛋白對正常人基質(zhì)細胞上述基因mRNA水平的影響，以探討DKK1在多發(fā)性骨髓瘤中的作用。 方法：采用Westernblot及ELISA方法，檢測骨髓瘤細胞系、CD138+原代骨髓瘤細胞、骨髓基質(zhì)細胞及細胞培養(yǎng)液DKK1蛋白表達情況，以及Realtime-PCR方法，檢測骨髓瘤細胞

4、系、CD138+原代骨髓瘤細胞、MM患者及正常人骨髓基質(zhì)細胞LRP5/6、Kremen1/2及β-cateninmRNA水平以及骨髓瘤細胞或重組DKK1蛋白與正常人骨髓基質(zhì)細胞共培養(yǎng)時上述基因mRNA水平。 結(jié)論：骨髓瘤細胞、MM患者及正常人基質(zhì)細胞之間LRP5/6、Kremen1/2及β-catenin基因轉(zhuǎn)錄水平存在差異，而骨髓瘤細胞分泌的DKK1可能是造成MM患者基質(zhì)細胞上述基因變化的重要因素。 第三部分DKK1的

5、真核表達、純化及功能測定 目的：表達和純化DKK1蛋白，研究骨髓瘤細胞及基質(zhì)細胞DKK1相關受體表達情況，并探討DKK1對骨髓瘤細胞及基質(zhì)細胞效應不同的可能機制。 方法：利用脂質(zhì)體介導pcDNA3.1(-)-DKK1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，使用westernblot方法鑒定上清中的表達蛋白，使用Ni-AgroseHis標簽蛋白純化試劑盒，純化融合His標簽的DKK1蛋白。利用流式細胞術(shù)(FCM)，對CD138+骨髓瘤細

6、胞、MM患者基質(zhì)細胞及健康志愿者基質(zhì)細胞表面DKK1相關受體表達情況進行同步分析比較。胞LRP5/6和Kremen1/2mRNA水平顯著高于正常人基質(zhì)細胞和CD138+原代骨髓瘤細胞。CD138+原代骨髓瘤細胞β-cateninmRNA水平高于MM患者及正常人基質(zhì)細胞。無論使用transwell小室或者直接接觸法進行骨髓瘤細胞系RPMI-8226、NCI-H929與正常人基質(zhì)細胞共培養(yǎng)48h及72h，LRP5/6、Kremen1/2mR

7、NA水平明顯增加，β-cateninmRNA水平下降，但24h變化不明顯。72h與48h相比，上述基因mRNA水平變化更加明顯。重組DKK1蛋白濃度為100ng/ml及300ng/ml時，與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)48h及72h后LRP5/6、Kremenl/2及β-cateninmRNA水平無明顯變化。重組DKK1蛋白濃度為500ng/ml時，培養(yǎng)48hLRP5/6mRNA水平有輕微上升(P＞0.05)，Kremenl/2mRNA水平有所上升(

8、P＜0.05)，及β-cateninmRNA水平略有下降(P＞0.05)；培養(yǎng)72hLRP5mRNA水平有所上升(P＜0.05)，LRP6mRNA水平無明顯變化(P＞0.05)；Kremen1/2mRNA水平有所上升(P＜0.05)，及β-cateninmRNA水平明顯下降(P＜0.05)。重組DKK1蛋白濃度為700ng/ml時，培養(yǎng)48h及72hLRP5/6、Kremen1/2mRNA水平明顯上升(P＜0.05)，及β-cateni

9、nmRNA水平明顯下降(P＜0.05)。 結(jié)論：骨髓瘤細胞、MM患者及正常人基質(zhì)細胞之間LRP5/6、Kremen1/2及β-catenin基因轉(zhuǎn)錄水平存在差異，而骨髓瘤細胞分泌的DKK1可能是造成MM患者基質(zhì)細胞上述基因變化的重要因素。 第三部分DKK1的真核表達、純化及功能測定 目的：表達和純化DKK1蛋白，研究骨髓瘤細胞及基質(zhì)細胞DKK1相關受體表達情況，并探討DKK1對骨髓瘤細胞及基質(zhì)細胞效應不同的可能機

10、制。 方法：利用脂質(zhì)體介導pcDNA3.1(-)-DKK1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染293T細胞，使用westernblot方法鑒定上清中的表達蛋白，使用Ni-AgroseHis標簽蛋白純化試劑盒，純化融合His標簽的DKK1蛋白。利用流式細胞術(shù)(FCM)，對CD138+骨髓瘤細胞、刪患者基質(zhì)細胞及健康志愿者基質(zhì)細胞表面DKK1相關受體表達情況進行同步分析比較。 結(jié)論：脂質(zhì)體介導的質(zhì)粒pcDNA3.1(-)-DKK1體外轉(zhuǎn)染效率較高，